大粒香水稻叶绿体基因组特征分析

吴朝昕， 刘雪薇， 李祖军， 龙武华， 宫彦龙， 朱速松

(贵州省农业科学院 水稻研究所， 贵阳 550006 )

叶绿体是植物获取能量的重要细胞器，具有独立于核基因组的遗传体系。因为其基因序列保守，基因结构重排事件远低于核基因组,结构简单,一般为母系遗传，所以被用来揭示物种的进化与亲缘关系(李绪英等，2011；
Li et al., 2018; Zhang et al., 2018; Jeon & Kim, 2019;朱斌等，2021)。由于发达的测序科技使不少生物实现了叶绿体基因组(cpDNA)测序，因此NCBI中收录的叶绿体基因逐渐增多，利用叶绿体基因研究亲缘关系的报道也不断增多。在水稻中，Fan等(2020)利用cpDNA分析了33个稻属物种的亲缘关系，结果显示OryzasativavoucherHSAGSDYD1802与O.sativacultivar TN1、O.sativacultivar RP Bio-226和O.sativacultivar IR8的亲缘关系最近。Fang等(2017)通过分析cpDNA探讨了根茎野生稻与其他13个稻属物种的亲缘关系，结果显示与根茎野生稻关系较近的是药用野生稻且属于CC基因类型。在其他物种中，张慧等(2018)利用cpDNA分析了益母草及其他16个物种的亲缘关系，研究结果很好地解决了野芝麻亚科的进化关系。郑祎等(2020)用大花君子兰叶绿体基因序列与10个百合科、5个兰科、4个鸢尾科及5个石蒜科共24个物种的叶绿体基因组序列进行系统发育分析，研究结果支持大花君子兰属于石蒜科，并使用其中23个物种叶绿体基因组中ycf2进行亲缘关系分析发现，叶绿体基因组中ycf2可以代替叶绿体基因组全长进行亲缘关系分析。

大粒香是贵州省水稻研究所选育，具有稻米粒大且香的特点，并且大粒香在乡村振兴过程中为社会带来了较高的经济效益(蒋志谦，2008；
罗仁发等，2012)。目前，对大粒香基因组学、品质形成等理论研究的文献报道不多。基于大粒香在贵州优质稻发展过程中的重要性，为进一步从基因组水平认识和改良大粒香，本研究以大粒香DNA为材料进行测序，构建大粒香cpDNA图谱，分析密码子的使用和重复序列，并分析其亲缘关系，拟解决大粒香叶绿体基因组以下问题：(1)大粒香cpDNA的基本特征大小；
(2)大粒香cpDNA密码子偏好情况；
(3)大粒香cpDNA系统发育所属分支。

1.1 材料

以大粒香为材料，2019年冬季种植于海南三亚师部农场基地，2020年2月选取无病虫害、长势良好的水稻叶片，冲洗、擦干液氮速冻暂存，用干冰保存寄回贵州，置于-80 ℃保存，用于提取大粒香DNA。

1.2 方法

1.2.1 大粒香DNA 提取及测序 使用TIANGEN植物DNA试剂盒提取大粒香总DNA，测序公司检测合格后，构建文库，进行测序。

1.2.2 cpDNA序列组装与注释 将原始数据,除去有污染、低质量的片段，使用SPAdes软件拼接后组装。使用CPGAVAS2进行基因注释，利用OGDRAW绘制大粒香的cpDNA图谱。

图 1 大粒香叶绿体基因组图谱Fig. 1 Gene map of Dalixiang chloroplast genome

1.2.3 密码子使用分析 使用CodonW进行密码子使用分析。

1.2.4 重复序列分析 使用Vmatch完成大粒香cpDNA的长重复序列的查找。大粒香cpDNA的SSR筛选则使用MISA软件，该软件的检测参数：单核苷酸大于8时被检测；
二核苷酸和三核苷酸大于4时被检测。

1.2.5 系统进化分析 为探究大粒香与其他稻属物种的亲缘关系，从NCBI中下载了12个稻属物种和2种禾本科近源物种的cpDNA(绿竹和高粱)，使用RaxML软件构建系统发育树。

2.1 大粒香cpDNA序列特征

大粒香cpDNA全长为134 563 bp，分为3个区：大单拷贝区(large single copy，LSC)(80 864 bp)，GC含量为37.09%；
小单拷贝区(small single copy，SSC)(12 347 bp)，GC含量为33.37%；
反向重复序列区(inverted repeats，IRs)(20 676 bp)，GC含量为44.41%。在大粒香cpDNA中注释129个基因(表1)，可分为三类，即蛋白编码基因、tRNA基因和rRNA基因，其数量分别为85、36和8。其基因功能主要为与自身复制能力有关、与光合作用有关、与其他基因和与未知功能有关4种。在蛋白编码基因中，rps基因的数量最多有16个，而cemA、infA、ccsA、rbcL、matK、accD、clpP等基因数量仅有1个。其中，有20个基因出现在IR重复区内，分别为ndhB、ycf1、rps12、rps7、rps15、rps9、rpl2、rpl23 8个蛋白编码基因，rrn23S、rrn4.5S、rrn16S、rrn5S4个核糖体RNA，trnN-GUU、trnH-GUG、trnA-UGC、trnL-CAA、trnT-CGU、trnV-GAC、trnR-ACG、trnM-CAU8个转运RNA(表1)。统计结果显示，大粒香cpDNA中有内含子的基因共17个，其中ycf3有2个，剩余16个基因只有1个。trnK-UUU的内含子碱基数最多，而trnL-UAA的最少(表2)。

表 1 大粒香cpDNA注释基因列表Table 1 List of genes found in Dalixiang cpDNA

表 2 大粒香cpDNA含有内含子的基因Table 2 Genes with introns in cpDNA of Dalixiang

2.2 大粒香cpDNA密码子使用分析

在大粒香cpDNA密码子中，亮氨酸密码子使用了1 944次，为最多；
半胱氨酸的密码子仅使用198次，为最少。在编码大粒香cpDNA的密码子中有30个密码子偏好性>1，其中以A结尾的有12个，以U(T)结尾的有16个，这表明大粒香cpDNA密码子偏好A/U(T)碱基，这种情况常出现在杜梨、益母草等多种高等植物中(张慧等，2018；
李泳潭等，2020；
郑祎等，2020)(表3)。

表 3 大粒香cpDNA密码子使用Table 3 Codon usage in cpDNA of Dalixiang

2.3 大粒香cpDNA长重复序列和SSR分析

在大粒香cpDNA中检测到19个长重复序列，包含了8个正向重复，长度范围为30～52 bp，以及11个回文重复，其长度范围为30～127 bp。最长的127 bp的重复序列位于rps19-psbK的基因间隔区内，而含有最多长重复序列的区间为racL-accD。区域位置分布显示，绝大多数分布在基因间隔区内(表4)。

表 4 大粒香cpDNA的重复序列Table 4 cpDNA repeat sequence of Dalixiang

在大粒香cpDNA的129个SSR位点中有95个单核苷酸重复,并且70.07%的SSR由A或T组成，表明SSR位点有使用A/T碱基的偏好。同时，研究表明SSR位点在大粒香cpDNA上分布不均，在LSC区、SSC区以及IRs区分别分布了95个、18个和16个SSR位点(表5)。

表 5 大粒香cpDNA中的简单重复序列Table 5 SSR in the cpDNA of Dalixiang

续表5

2.4 大粒香cpDNA系统发育分析

将大粒香与粳稻、籼稻、野生稻及2个外类物种等共15个cpDNA序列构建发育树。发育树分析表明，15个物种可分为三类，即第一类为Bambusaoldhamii，第二类为Sorghumbicolor，第三类为13个稻属物种组成。在第三类群中又可分为4个小类群，其中3种野生稻(O.australiensis300316、O.meridionalis、O.ruifipogon)各为一类，其余10种栽培稻为一类。在栽培稻类群中，粳稻与籼稻分别处于不同进化分支。并且，大粒香水稻与粳稻Tropical Japonica在同一分支，表明两者的进化关系比其他水稻品种近(图2)。

图 2 15种植物的cpDNA序列的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree constructed using cpDNA of 15 plants

本研究测得大粒香cpDNA全长为134 563 bp，GC含量为39%，LSC为80 864 bp，SSC为12 347 bp，IR为20 676 bp，并注释到129个基因，与已报道的禾本科数据相符(李裕华等，2020)。前人通过比对不同禾本科植物cpDNA序列表明，虽然叶绿体基因保守程度较高，但一些基因在进化过程中仍然出现退化缺失现象(唐萍等，2011；
付涛等，2016)。本研究将大粒香cpDNA与Wang等(2016)报道的热带粳稻叶绿体基因组进行比对结果显示，虽然二者在细胞色素b/f复合体相关基因、光系统Ⅰ、Ⅱ相关基因、核糖体蛋白大和小亚基相关基因、tRNA和未知功能基因等基因差异较少，但在大粒香叶绿体基因中不存在lhbA基因。lhbA基因是和光合作用过程中光系统Ⅱ有关的基因，在热带粳稻中存在lhbA基因，并且在喜好温暖的禾本科植物毛竹中同样也存在lhbA基因(Yao et al., 2016)，这可能是热带粳稻为适应热带光温生长环境中逐渐进化而得。

SSR位点可被用于辅助育种和遗传连锁作图等方面的研究，而cpDNA具有序列保守、结构稳定、易测序等优点，有助于解决类群间的遗传多样性(Powell et al., 1995; Pugh et al., 2004;Song et al., 2019)。本研究结果表明，大粒香cpDNA的SSR位点对A/U(T)碱基有着明显偏好，这与前人研究结论相一致(张慧等，2018；
李泳潭等，2020；
郑祎等，2020；
王一麾等，2021；
吴朝昕等，2021)。此外，大粒香cpDNA的密码子也偏好A/U(T)碱基，这种密码子使用情况也存在于其他物种中(Shinozaki et al., 1986;Ohyama et al., 1988;郑祎等，2020；
朱斌等，2021；
吴朝昕等，2021)。大粒香cpDNA编码蛋白质的密码子和SSR位点都偏好A碱基或者U(T)碱基，可能是造成大粒香cpDNA总A/U(T)含量大于总GC含量的原因。根据Niu等(2007)的研究报道，因为A/T核苷酸含有7个氮原子，比G/C核苷酸少一个， 所以富含A/T核苷酸耗能更少，有利于cpDNA的复制。这可能是大粒香cpDNA富含A/U(T)的原因。

系统发育基因组学是利用分子数据来研究生物间发育关系的。由于cpDNA具有序列保守、结构稳定、易测序等优点，因此基于cpDNA进行的系统发育研究得到了很好的发展(Eisen,1998; Eisen & Hanawalt,1999; Delsuc et al., 2005)。本研究对优质稻大粒香cpDNA测序数据进行了系统发育分析，研究结果表明大粒香与热带粳稻聚为一类；
粳稻与籼稻不为一类，这一结果与林张翔等(2014)的研究结果相同，支持了Huang等(2012)的籼粳稻起源假说。

综上所述，本研究所获得的大粒香的cpDNA大小、结构、基因数量、重复序列、密码子偏好、系统发育树等特征信息，为进一步研究大粒香的系统进化和育种研究提供了理论依据。