不同生境人参茎叶总皂苷对免疫抑制小鼠的作用比较

张静雯，房庆伟，李 坤，叶 冠

(上海医药集团股份有限公司中央研究院，上海 201203)

药用人参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根茎，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效。人参的人工栽培品称为园参，而在山林野生状态下播种，不受人工干预、自然生长者称为林下山参，俗称“籽海”[1]。相较于人参根茎，人参茎叶资源丰富、价格低廉，其产量逐年增加，相关产品的开发研究也日益增多[2]。人参茎叶中含有丰富的皂苷类成分，其药理活性强，具有抗肿瘤、抗衰老、促进细胞增殖、免疫调节等作用[3-4]。目前市场上流通的人参茎叶主要来源于园参，林下山参的茎叶未得到充分利用。然而，林下山参长于山野林间，生长年限长，所含人参皂苷的量与野山参较为相近且优于园参[5]。因此，林下山参茎叶潜在的药用价值可能更胜于园参茎叶。为避免林下参茎叶资源的进一步浪费，对其进行深入开发利用具有重要意义。

目前林下参茎叶相关的药效学研究较少，本研究主要从人参茎叶总皂苷的免疫调节活性入手，研究不同生境人参(园参、林下参)茎叶总皂苷对免疫抑制小鼠的免疫增强作用，并进行药效比较，以期为人参茎叶的资源扩充与其药用价值的充分开发提供参考。

1.1 材料

1.1.1 实验材料 园参茎叶及林下参茎叶样品，由叶冠教授级高级工程师鉴定为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥茎叶。园参茎叶总皂苷与林下参茎叶总皂苷均由实验室提取分离而得，制法参考《中华人民共和国药典》一部人参茎叶总皂苷项下提取方法[6]。经检测，园参茎叶总皂苷中人参总皂苷含量为77.37%，人参皂苷Rg1、Re、Rd含量之和为34.06%，林下参茎叶总皂苷中人参总皂苷含量为77.07%，人参皂苷Rg1、Re、Rd含量之和为37.46%，二者均符合药典标准。

1.1.2 实验动物 SPF级ICR小鼠80只，体质量(20±2) g，雌雄各半，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2017-0040。

1.1.3 试剂 注射用环磷酰胺(CTX)(批号：H32020857)，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；
氯化钠注射液(批号：A17111105)，购自河北天成药业股份有限公司；
小鼠免疫球蛋白G(IgG)(批号：MM-0057M1)、小鼠免疫球蛋白M(IgM)(批号：MM-0058M1)酶联免疫分析试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司；
PE anti-mouse CD3(批号：4AD122130F)、FITC anti-mouse CD4(批号：4AD122131F)、FITC anti-mouse CD8(批号：4AD122131F)，购自北京四正柏生物科技有限公司。

1.1.4 仪器 BSA 224S电子天平(德国赛多利斯公司)；
热电MultiskanFC酶标仪、Attune NxT流式细胞仪(美国Thermo Scientific公司)；
UV-5100紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；
D3024R台式高速冷冻离心机(美国Scilogex公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及给药 将ICR小鼠随机分为8组(每组10只)：空白对照组(NC)，模型组(M)，园参茎叶总皂苷低(YSD)、中(YSZ)、高(YSG)剂量组(10、20、40 mg/kg)，林下参茎叶总皂苷低(LXD)、中(LXZ)、高(LXG)剂量组(10、20、40 mg/kg)。除空白对照组外，其余各组小鼠连续3 d皮下注射环磷酰胺60 mg/kg，造成小鼠免疫抑制模型。造模完成后，每天灌胃给药1次，空白对照组和模型组给予等量生理盐水，连续给药14 d。

1.2.2 ELISA检测血清IgG、IgM水平 各组小鼠摘眼球取血，血液样本经3 000 r/min离心10 min后，分离血清，根据ELISA试剂盒说明书测定血清中IgG、IgM的含量。

1.2.3 流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞及其亚群分布 各组小鼠眼眶取血，取全血50 μL，依次加入CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-FITC单克隆抗体，置于流式细胞仪检测并计数，计算CD3+细胞、CD3+CD4+细胞与CD3+CD8+细胞的含量。

2.1 小鼠血清免疫球蛋白细胞水平测定结果

测定小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgM水平，结果显示，较空白对照组，模型组小鼠血清IgG、IgM水平均显著降低(P<0.01)；
与模型组相比，园参茎叶总皂苷及林下参茎叶总皂苷各剂量组小鼠血清IgG、IgM水平均显著升高(P<0.01)；
与园参茎叶总皂苷组小鼠相比，林下参茎叶总皂苷组小鼠在给予相同剂量的条件下，其血清IgG、IgM水平更高(P<0.01)。结果见表1、图1。

注：与模型组比较，**P<0.01；
YSD、YSZ、YSG分别与LXD、LXZ、LXG比较，##P<0.01。

2.2 小鼠外周血淋巴细胞亚群检测结果

流式细胞术检测小鼠外周血淋巴细胞及其亚群分布，结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠血液CD3+、CD3+CD4+细胞含量比例降低(P<0.05)，CD3+CD8+细胞含量比例升高(P<0.05)；
与模型组比，园参茎叶总皂苷与林下参茎叶总皂苷各剂量组小鼠血液CD3+、CD3+CD4+细胞含量比例升高(P<0.05)，CD3+CD8+细胞含量比例降低(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖性。比较林下参茎叶总皂苷低、中、高剂量组与园参茎叶总皂苷对应低、中、高剂量组CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞含量比例，结果显示低剂量组CD3+细胞含量比例有所差异(P<0.01)，高剂量组CD3+CD4+细胞含量比例差异较小(P<0.05)，其余剂量组CD3+细胞、CD3+CD4+细胞含量无明显差异；
园参茎叶总皂苷与林下参茎叶总皂苷对应各剂量组比较，CD3+CD8+细胞含量无明显差异。结果见表2、图2。

表2 园参茎叶皂苷与林下参茎叶皂苷对免疫抑制小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；
YSD、YSZ、YSG分别与LXD、LXZ、LXG比较，#P<0.05，##P<0.01。

目前，环磷酰胺、氢化可的松及地塞米松等药物是诱导小鼠免疫抑制模型的主要造模剂，其中，关于环磷酰胺的应用最多[7]。环磷酰胺可通过抑制DNA合成，干扰核酸的复制与转录等途径抑制免疫细胞的增殖，从而使免疫系统处于抑制状态[8]。本研究采用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，研究林下参茎叶总皂苷和园参茎叶总皂苷对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。

体液免疫主要通过浆细胞释放抗体来产生免疫应答，因此血清免疫球蛋白水平为体液免疫功能检测的常用指标。IgG是机体再次免疫应答过程中产生的主要抗体，有抗菌、抗外毒素及抗病毒的活性；
IgM是体液免疫中最早合成并分泌的抗体，能凝集细菌和病毒、中和毒素，在肿瘤免疫中起到重要作用[9]。本研究结果表明，林下参茎叶总皂苷组和园参茎叶总皂苷组小鼠血清IgG、IgM水平较模型组小鼠有所升高，表明二者均能改善小鼠的体液免疫功能。此外，在相同的给药剂量条件下，林下参茎叶总皂苷具有更强的免疫增强效果。

T淋巴(CD3+)细胞可分为CD4+、CD8+两个亚群。CD4+T淋巴细胞，又称辅助性T淋巴细胞(help T cell，Th)，可分泌多种趋化因子及细胞因子，激活并募集靶细胞，在细胞免疫过程中发挥着关键作用[10]。CD8+T淋巴细胞，又称细胞毒性T淋巴细胞，在清除体内的各种病原体和肿瘤细胞方面具有重要意义[11]。CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例失调，说明T细胞免疫功能失常[12]。小鼠处于免疫抑制时，其外周血中CD3+细胞、CD4+T细胞含量下降，CD8+T细胞含量上升。本研究结果显示，林下参茎叶总皂苷和园参茎叶总皂苷均可增加免疫抑制小鼠外周血CD4+T细胞的数量，减少CD8+T细胞的数量，但组间差异不大，表明二者均能增强免疫低下小鼠的细胞免疫功能。

综上所述，本研究结果说明了园参茎叶总皂苷和林下参茎叶总皂苷均能通过促进免疫低下小鼠的细胞免疫、体液免疫功能，来增强免疫抑制小鼠的免疫功能。在改善模型组小鼠体液免疫方面，林下参茎叶总皂苷的效果更好。本研究首次证实了林下参茎叶免疫增强的药效作用，为人参茎叶药用来源的扩充、林下参茎叶的现实应用提供了实验依据。后续可深入研究林下参茎叶发挥免疫增强作用的机制。此外，不同生境的人参茎叶总皂苷种类、含量与药效均不相同，因此二者间的药效差异性成分仍需进一步探讨。