miR-148-3p抑制剂下调Akt2调控HUVECs细胞增殖及凋亡机制研究*

李汭澧，齐晓娅，武明星，梅 英△

(重庆医科大学附属第二医院 1.健康管理(体检)中心；
2.眼科，重庆 400010)

健康的角膜是透明且无血管的，如果出现由新生血管发展导致的病理变化即为角膜新生血管(corneal neovascularization,CRNV)[1-2]，CRNV发生通常由外伤、缺氧、炎症等引起[3]，尽管近年来CRNV治疗取得了较大进展，但现阶段尚无安全有效的治疗方案，因此，探索CRNV的可能发病机制对其进一步诊断和治疗至关重要。

蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)是调节细胞增殖、分化的常见信号转导蛋白，参与了血管生成的生理和病理过程[4]，SHEN等[5]研究发现磷脂酰肌醇肌酶(PI3K)/Akt信号通路与CRNV发生发展有关。

微RNA(microRNA，miR)是一类内源性非编码RNA，通过转录后调节基因表达，从而参与多种病理进程。已有研究证实miRNA在新生血管性眼病发病机制中扮演重要角色。如在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs) 株中，miR-1275和miR-1246可以通过抑制血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)和核因子-κB激活蛋白(NKAP) 来调节与血管生成相关的因子活性[6]。本研究前期通过TargetScan 软件预测发现Akt2的3′-UTR与miR-148-3p存在结合位点。虽有研究证明多种miR与新生血管性眼病相关，但miR-148-3p作用尚未明确。本研究旨在观察miR-148-3p抑制剂(inhibitor)在调节模拟角膜新生血管形成常见体外细胞模型HUVECs[7]的增殖机制，分析miR-148-3p inhibitor可能通过调控 Akt2 的表达对 HUVECs 增殖能力影响，进而揭示miR-148-3p在CRNV中的作用及其机制。

1.1 细胞与试剂

HUVECs购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、miR-148-3p inhibitor、过表达Akt2质粒载体及各自阴性对照、实时荧光定量PCR(qRT-PCR()试剂盒、BCA 蛋白质定量试剂盒、电化学发光(ECL)发生液、TRIzol®试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司。CCK-8试剂盒、Akt2及GAPDH一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和分组

HUVECs置于37 ℃含95% N2和5% CO2的细胞培养箱中，使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养。待细胞生长融合度至70%时，按照转染试剂LipofectamineTM2000试剂盒说明书对细胞进行转染。为了探究miR-148-3p对HUVECs增殖能力的影响，将HUVECs分为：空白对照组(HUVECs不作任何处理)、NC inhibitor组(转染NC inhibitor)、miR-148-3p inhibitor组(转染miR-148-3p inhibitor)。为了探究miR-148-3p和Akt2 对HUVECs增殖能力的影响，将HUVECs分为：NC组(转染过表达质粒Akt2的阴性对照)、Akt2组(转染过表达Akt2质粒)、NC inhibitor组、miR-148-3p inhibitor组、miR-148-3p inhibitor+Akt2 组(共转染miR-148-3p inhibitor和过表达Akt2质粒)。

1.2.2qRT-PCR实验

使用TRizol从各组细胞中提取总RNA，反转录合成 cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应，U6作为miR-148-3p的表达内参，GAPDH作为Akt2 mRNA的表达内参。实验重复3次。扩增基因及引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性10 min；
94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次。反应体系为20 μL:2×SYBR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，10×cDNA 模板1 μL，H2O 8 μL。

1.2.3CCK-8实验

HUVECs接种于96孔板，调整密度为1×105/mL，常规培养24、48、72、96 h后检测细胞增殖情况，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室温5% CO2培养箱孵育2 h后，酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值。实验重复3次。

1.2.4末端DNA转移酶dUPT缺口末端标记(TUNEL)实验

收集细胞，用4%多聚甲醛固定细胞30～60 min，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴2 min。在用甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液室温孵育20 min。在样品上加50 μL生物素标记液，37 ℃孵育60 min。滴加0.1～0.3 mL反应终止液，室温孵育10 min。在样品上加50 μL Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min。滴加 0.2～0.5 mL DAB显色液，室温孵育5～30 min或根据显色情况孵育适当时间。用苏木素染液进行细胞核染色。95%乙醇脱水5 min，再用100%乙醇脱水2次，每次约3 min，再用二甲苯透明 2次，每次5 min，随后封片观察。TUNEL染色标本根据阳性细胞分布情况，选择2个阳性视野，计数 200 个细胞中阳性细胞数占比作为凋亡指数(AI)并进行统计。实验重复3次。

表1 扩增基因及引物序列

1.2.5miR-148-3p和Akt2的结合位点预测及双荧光素酶报告基因实验验证

使用TargetScan数据库预测miR-148-3p和Akt2的结合位点 (http://www.targetscan.org/vert_71/)。构建Akt2野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-Akt2-wt和突变型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-Akt2-Mut。将pMIR-Akt2-wt或pMIR-Akt2-Mut与NC-inhibitor或miR-148-3p inhibitor共转染进HUVECs。转染24 h后，使用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.2.6蛋白免疫印迹法(Western blot)实验

采用RIPA裂解液提取HUVECs总蛋白，遵照BCA法测定蛋白浓度，变性蛋白。每泳道加入50 μg总蛋白，用12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h。加入一抗Akt2抗体(1∶500)，GAPDH抗体(1∶1 000)，GAPDH为内参。4 ℃孵育过夜。加入HRP标记的兔二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h。ECL液暗室发光显影，采集图像并分析。实验重复3次。

1.3 统计学处理

2.1 miR-148-3p inhibitor抑制HUVECs的增殖能力

CCK-8实验结果显示，常规培养24 h时，空白对照组、NC inhibitor组、miR-148-3p inhibitor组的细胞增殖能力(A值)差异无统计学意义(P>0.05)；
常规培养48、72、96 h时，miR-148-3p inhibitor组的细胞增殖能力(A值)明显低于空白对照组、NC inhibitor组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 miR-148-3p inhibitor对HUVECs增殖能力的影响

2.2 miR-148-3p inhibitor下调HUVECs中Akt2表达

TargetScan筛选结果显示，miR-148-3p在Akt2的3′-UTR上具有潜在的结合位点(图2A)，qRT-PCR结果显示，转染miR-148-3p inhibitor后，细胞中miR-148-3p的表达(0.29±0.03)明显低于NC inhibitor组的(1.00±0.05)，差异有统计学意义(t=21.090，P<0.001)，见图2B，证明转染成功。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-148-3p inhibitor组pMIR-Akt2-wt质粒荧光素酶活性(26.41±3.01)与NC inhibitor组(25.37±2.41)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，miR-148-3p inhibitor组pMIR-Akt2-Mut质粒荧光素酶活性为(26.45±2.03)，NC inhibitor组荧光素酶活性为(25.13±2.31)，2组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2C。因此Akt2非miR-148-3p直接靶基因。但Western blot检测结果表明，miR-148-3p inhibitor组Akt2表达水平为(0.14±0.03)，明显低于NC inhibitor组的0.87±0.12(t=10.222，P<0.05)，见图2D，提示miR-148-3p抑制剂可负调控Akt2表达。

2.3 过表达Akt2促进HUVECs增殖并抑制凋亡

采用CCK-8法检测Akt2对细胞增殖能力的影响，结果显示，Akt2组除24 h外，其余各时间点的细胞增殖能力(A值)均明显高于NC组(P<0.05),见表1。TUNEL实验结果显示，与NC组(0.72±0.14)比较，Akt2组(0.41±0.08)HUVECs的AI值减少(P<0.01)，见表1、图3。

A：TargetScan生信图；
B：转染实验；
C：双荧光素酶报告基因实验；
D：Western blot；
a：P<0.01，与NC inhibitor组比较。

表1 各组HUVECs细胞增殖能力(A值)、AI值比较

图3 过表达Akt2抑制HUVECs凋亡

2.4 miR-148-3p inhibitor通过下调Akt2表达，抑制HUVECs增殖并促进凋亡

采用CCK-8法检测miR-148-3p inhibitor和Akt2对细胞增殖能力(A值)的影响，结果显示，与NC inhibitor组比较，miR-148-3p inhibitor组24、48、72、96 h时增殖能力降低；
而miR-148-3p inhibitor +Akt2组各个时间节点的HUVECs 增殖能力均不同程度高于miR-148-3p inhibitor组，见表2。TUNEL实验结果显示，与NC inhibitor组比较，miR-148-3p inhibtior组HUVECs的AI值增加(P<0.01)，miR-148-3p inhibitor+Akt2组的AI值明显低于miR-148-3p inhibtior组(P<0.01)，见表2、图4。

图4 miR-148-3p调控 Akt2 影响HUVECs凋亡能力

表2 各组HUVECs细胞增殖能力(A值)、AI值比较

CRNV作为常见的眼部疾病，近年越来越多的研究集中在新生血管形成的机制上[8]。HUVECs可用来模拟CRNV形成，徐萌等[9]使用HUVECs探究马钱子碱对血管形成活性物质的抑制作用；
BAI等[10]用VEGF刺激人脐HUVECs体外诱导CRNV细胞，从而探究长链非编码RNA(lncRNA) MIAT 在抑制角膜血管生成的作用。

近年，miR被证实参与了眼部疾病的发生发展，尤其是与血管新生相关，既往研究显示miR-148-3p与炎症、免疫、血管生成等生理病理过程相关[11-12]，但miR-148-3p在CRNV中的具体作用效果和相关机制却鲜有报道。本研究利用CRNV形成常见体外细胞模型HUVECs，分析miR-148-3p的差异表达对CRNV的作用机制，即miR-148-3p对CRNV是否具有重要调控作用。本研究结果显示，下调miR-148-3p能抑制HUVECs的增殖能力，同时能促进细胞凋亡。

Akt作为常见信号转导蛋白，参与调节细胞增殖、分化、血管生成等生理和病理过程。SAMAKOVA等[13]研究发现，缺血时PI3K/Akt通路与血管生成、氧化应激及间充质干细胞存活相关；
有研究发现，miR-21通过 PI3K/Akt/VEGF通路抑制糖尿病视网膜病变的视网膜血管内皮细胞生长和血管生成[14]。与以往高质量研究结果类似，本研究发现过表达Akt2明显促进了HUVECs增殖，同时抑制了HUVECs的凋亡。

为了进一步探究miR-148-3p对Akt2的调控机制[15]，生物信息学分析发现Akt2可能是 miR-148-3p潜在靶点，但miR-148-3p抑制剂对 Akt2 的双荧光素酶强度无明显影响，因此说明Akt2可能不是miR-148-3p的直接靶点，但Western blot初步证实miR-148-3p抑制剂可负调控Akt2表达。

本文利用CRNV形成常见体外细胞模型HUVECs进一步探究miR-148-3p和Akt2对HUVECs增殖和凋亡的影响，初步证实miR-148-3p inhibitor可通过下调Akt2的表达抑制HUVECs增殖，随后采用TUNEL实验进行验证，发现miR-148-3p inhibtior可以促进HUVECs凋亡，Akt2组明显抑制了HUVECs的凋亡，而Akt2抑制了miR-148-3p inhibitor促进HUVECs 凋亡的能力。

综上，此次研究利用CRNV形成常见体外细胞模型HUVECs，分析了miR-148-3p对CRNV的影响，在体外验证了miR-148-3p inhibtior通过下调Akt2 的表达对CRNV形成有抑制作用。目前，临床治疗CRNV的药物较多，部分药物可通过调控某些miR来实现对CRNV的抑制。本研究结论为CRNV的治疗靶点选择提供了新的参考和客观依据。然而，本研究为体外实验研究，人体内源性miR-148-3p在角膜血管化中的具体作用过程较为复杂，涉及多条信号传导通路，且各种miR间可能存在相互影响，一种miR有可能通过调节另外一种miR的表达而发挥相关的调节作用。由于客观条件的限制，本研究仅探索了miR-148-3p这一单一miR对HUVECs增殖、凋亡的影响，在后续的研究中将拓展研究范围和深度，进一步分析miR在CRNV中的作用效果及相关机制。