Bcl-2,家族在脐带间充质干细胞外泌体改善阿霉素心肌损伤中的作用

李艺养，罗鸿伟，田 川，马国达，陈日玲（.广东医科大学附属医院儿科，广东湛江 54000；
.广东医科大学附属顺德妇女儿童医院儿科，广东佛山 58300）

阿霉素（Dox）广泛应用于治疗儿童白血病、淋巴瘤等多种恶性肿瘤，由于使用频率及剂量较高，容易导致体内的蓄积，可致多种毒副作用，其中最明显的毒副作用是心脏毒性，甚至10 % 的患者在化疗结束后15 a内会出现症状性心肌病[1]。国内外已证实外泌体对心血管疾病有损伤修复作用[2]。本研究旨在探索脐带血间充质干细胞源性的外泌体逆转阿霉素诱导的心肌细胞损伤及其潜在的机制。

1.1 主要试剂

脐带间充质干细胞购自苏州赛业生物科技有限公司；
AnnexinV-FIFC/PI 细胞凋亡试剂盒购自美国 BD 公司；
Bcl-2 antibody（C-2）（货号sc7382）、β-actin 抗体（货号sc-81178）、Caspase-3 antibody（H-277）（货号：sc-7272）购自美国Santa Cruz；
Bax antibody（E63）（货号：ab32503）购自美国Abcam；
Anti-CD81 antibody（货号：A01281-2）、Anti-Tsg101 antibody（货号：A01233-2）购自BOSTER Biological Technolog。

1.2 人脐带间充质干细胞外泌体的提取鉴定

于人脐带间充质干细胞基础培养基培养细胞生长至70%～80% 融合度时，更换基础培养基为无外泌体血清培养基，继续培养72 h 后收集细胞上清，通过逐步超高速离心法得到外泌体悬浮液。将外泌体悬浮液置于铜网行醋酸双氧铀染色液负染后，透射电子显微镜观察外泌体形态，纳米颗粒示踪分析仪Particle Metrix 系统检测外泌体粒径大小从而得到颗粒粒径的数量及浓度分布信息，Western-blot 蛋白印记检测外泌体表面标志物等方法鉴定外泌体。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 根据各组有无阿霉素及间充质干细胞外泌体浓度的不同，将鼠心肌细胞 H9C2 分为四组，（1）空白对照组（未给予任何剂量Exo 及Dox）；
（2）Dox组（加入0.2 mg/L 的Dox）；
（3）H-Exo+Dox 组（加入30 mg/L Exo 及0.2 mg/L 的Dox）；
（4）L-Exo+Dox 组（加入15 mg/L Exo 及0.2 mg/L 的Dox）。

1.3.2 AnnexinV-FIFC/PI 检测心肌细胞凋亡率 将H9C2 均匀铺板后放入5 % CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%～90% 融合时，根据不同分组予以不同浓度外泌体及Dox 处理，24 h 后消化并收集各组悬浮心肌细胞，然后再加入5 μL 的 Annexin V-FITC，充分混匀后，避光孵育15 min。于上机前5 min 再加入5 μL 的PI 染色继续避光孵育，上机时补加200 μL的1×Binding Buffer，并在1 h 内使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.3 Western-blots 检测心肌细胞凋亡蛋白 收集各组心肌细胞并提取蛋白，配平至一致浓度后上样，经过电泳、电转膜、封闭抗体、孵育一抗、孵育二抗后于凝胶成像仪分别检测Bax、Bcl-2、active Caspase-3 凋亡蛋白的表达水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0 软件，多组间比较采用LSD 单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 人脐带间充质干细胞的培养及外泌体的提取鉴定

2.1.1 脐带间充质干细胞的形态和外泌体形态 脐带间充质干细胞在显微镜细胞成像系统可见：细胞贴壁生长，大小相对一致，透光性好，高度纯化，聚集性生长，呈长梭形（图1）。透射电子显微镜下可见，脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形囊泡状，大小均匀，脂质双层膜完整透亮，见图 2 。

图1 hUCMSCs 细胞形态学

图2 透射电子显微镜观察脐带间充质干细胞外泌体形态

2.1.2 脐带间充质干细胞外泌体粒径大小与表面标志物 粒径范围集中于50～250 nm，平均粒径大小为136.1 nm，重悬液颗粒浓度为 6.5×107Particles/mL（见图3）；
浓度最高的颗粒的粒径为127.8 nm，其对应的浓度为 3.3×106Particles/mL。以细胞蛋白为对照组，Western-blot 检测外泌体表面标记蛋白CD81、TSG101呈阳性表达。

图3 外泌体粒粒径大小分布图注释

2.1.3 脐带间充质干细胞外泌体表面标志物 以细胞蛋白为对照组，Western-blot 检测外泌体表面标记蛋白CD81、TSG101 呈阳性表达，如图4 所示。

图4 Western-blot 检测外泌体表面蛋白

2.2 各组心肌细胞的凋亡率

Dox 组细胞凋亡率最高为（27.0±1.9）%，L-Exo+Dox 组、H-Exo+Dox 组、空白对照组细胞凋亡率逐渐降低[分别为（15.6±1.2）%、（9.6±0.1）%、（4.6±1.3）% ]，组间两两比较均P＜0.05。图5 为各组心肌细胞形态改变。

图5 各组心肌细胞形态

2.3 各组心肌细胞的凋亡蛋白变化水平

Dox 诱导心肌细胞凋亡后，Dox 组的促凋亡蛋白Bax 及Caspase-3 表达量最高，抑凋亡蛋白Bcl-2 表达量则最低，反映细胞抗凋亡能力的Bcl-2/Bax 比值也处于最低水平，而 L-Exo+Dox 组Bax 及Caspase-3 表达量较前者下调，Bcl-2 表达量则上升，Bcl-2/Bax 比值也上升；
H-Exo+Dox 组Bax 及Caspase-3 则下降更加明显，而Bcl-2 则进一步上调，Bcl-2/Bax 比值也随之上升；
Bax、Caspase-3、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值在Dox组与L-Exo+Dox 组的表达差异具统计学意义（P＜0.05），同时四者在L-Exo+Dox 组与H-Exo+Dox 组的表达差异具统计学意义（P＜0.05）。如表1 所示。

表1 各组心肌细胞凋亡蛋白表达差异 (，n=3)

表1 各组心肌细胞凋亡蛋白表达差异 (，n=3)

与 L-Exo+Dox 组比较：aP＜0.05;与空白对照组比较：bP＜0.05

阿霉素等蒽环类药物是治疗多种血液肿瘤的首选药物之一，但其临床应用受到剂量依赖性以及延迟性心脏毒性的限制。阿霉素导致的心脏损伤往往为不可逆性，主要表现为恶性心律失常、扩张性心肌病、心力衰竭等[3]。目前尚无有效的方法减少蒽环类药物心脏毒性，因此，需寻找有效的抗心肌损害药物。

阿霉素导致心肌细胞氧化应激增加凋亡被认为是导致心脏损害的重要机制之一，具体凋亡途径尚不明确。其中Bcl-2 蛋白家族依赖性的内在途径的特征在于通过线粒体外膜的透化作用和线粒体中可溶性因子的释放发挥氧化应激凋亡，分为BH3-only 蛋白、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[4-6]。BH3-only 蛋白当受有害刺激物激活，促凋亡蛋白Bax 和 Bak 开始形成寡聚体，在线粒体外膜上形成孔道，经此释放线粒体膜空间蛋白，以细胞色素C 最重要，进入细胞质，可瞬时结合关键的胱天蛋白酶（Caspase）接头分子凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1），触发Apaf-1 构象广泛变化，寡聚化为七聚体轮状结构，使得Caspase 活化，Apaf-1 与启动子Caspase-9 结合形成凋亡小体，在凋亡小体内Caspase-9的二聚化导致其被激活，继而裂解促凋亡直接执行者 Caspase-3 和Caspase-7，使细胞快速凋亡[4，7-8]。抗凋亡蛋白Bcl-2 则通过在Bcl-2 或Bcl-xL 与 Bax 之间形成异二聚体，阻止Bax 和Bak 的激活和聚合，以及关闭线粒体离子通道以降低线粒体膜的通透性，从而抑制细胞凋亡[5，9]。

外泌体是一种带有生物活性的细胞外囊泡，囊泡内含有多种功能性生物分子，如蛋白质、脂质、mRNA、miRNA、细胞因子等，通过将这些生物分子实现细胞间通讯作用[10]。研究表明，脂肪间充质干细胞、心脏祖细胞来源外泌体可减少阿霉素所致的心肌细胞凋亡[3，11]。本实验选取人脐带间充质干细胞外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）进行研究，免疫原性低而少有免疫排斥反应，且具备更高的传代及向多个胚层分化的能力[12]。

本实验中Dox 浓度、外泌体的浓度梯度是本课题组前期进行Dox 诱导心肌损伤模型预实验得出来的。以阿霉素诱导损害的心肌细胞为研究对象，观察不同浓度脐带间充质干细胞外泌体处理后各组心肌细胞的的凋亡率。结果发现适量的脐带间充质干细胞外泌体可在一定程度上降低阿霉素诱导的心肌细胞的凋亡率，且随着外泌体浓度增高，降低凋亡率的程度增强，差异有显著性，提示脐带间充质干细胞外泌体可降低阿霉素诱导心肌细胞的凋亡作用，且一定范围外泌体浓度增强，其抗心肌细胞凋亡能力增强。

为进一步研究外泌体降低阿霉素诱导的心肌细胞的凋亡作用的机制，本研究检测各组阿霉素诱导损伤的心肌细胞经不同浓度脐带间充质干细胞外泌体处理后的Bax、Caspase-3、Bcl-2 表达水平。研究结果示，Dox 组 Bax 及Caspase-3 蛋白高表达，而Bcl-2 低表达，我们推测阿霉素诱导心肌细胞损害可能经Bcl-2 蛋白家族依赖性的内在途径，最终使心肌细胞快速凋亡。并且研究结果显示，与Dox 组相比，L-Exo+Dox 组、H-Exo+Dox 组Bax 及Caspase-3 表达降低，而Bcl-2 表达量升高，反映细胞抗凋亡能力的Bcl-2/Bax 比值也随之升高，且随着外泌体浓度增高，Bax 及Caspase-3 表达量降低更明显，Bcl-2 表达量增加更明显（P＜0.05），说明经脐带间充质干细胞外泌体处理后心肌细胞凋亡率降低可能与Bcl-2 蛋白家族依赖性的内在途径的Bax及Caspase-3 表达量降低、Bcl-2 表达量增加有关，从分子学水平解释了外泌体降低阿霉素诱导的心肌细胞的凋亡作用，且一定范围外泌体浓度增强，其抗心肌细胞凋亡能力增强。Zhang 等[13]、Jing 等[14]研究也证实此分子水平变化。

另外，也有学者指出间充质干细胞外泌体可通过联合多种机制改善心脏损害。Ma 等[15]研究发现骨髓间充质干细胞外泌体可通过递送miR-132 促进新血管生成以改善心肌梗塞；
Arslan 等[16]在动物实验中发现间充质干细胞来源的外泌体可增加ATP 水平，降低氧化应激并激活PI3K/ Akt 途径，从而增强心肌活力并防止心肌缺血再灌注损伤的重塑。因此，间充质干细胞外泌体对心肌功能的改善并非是单一的通路机制，可能是多种途径联合的综合结果，但这仍需进一步的研究。