香辛料对酱卤牛肉的赋味效应解析

姜薇，强宇，刘成江，黄峰，张春晖,*，韩东*

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）（2.新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆乌鲁木齐 830049）

酱卤肉制品是我国最重要的中式传统肉制品之一，其风味独特，具有较高的营养价值，近年来受到越来越多消费者的欢迎。滋味是衡量肉制品感官品质和消费品质的重要指标，酱卤牛肉特征滋味与其加工过程中香辛料的应用密切相关。而在酱卤牛肉加工过程中香辛料的添加更多依赖于经验手工，缺乏科学的数值化复配技术，导致香辛料的利用率不足，产生大量卤制废料，造成资源的浪费，是亟待解决的行业技术难题[1]。但香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质种类和含量尚不明晰，因此开展香辛料的赋味效应研究，实现从“难以预料”到“不出所料”的转变，为酱卤肉制品香辛料的科学复配提供技术支持。

肉中主要的游离氨基酸是谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸等，主要的呈味物质是肌苷酸、鸟苷酸[2]。而酱卤肉制品加工过程中的主要环节是调味和煮制[1]，酱卤牛肉独特的风味与其加工过程中香辛料的应用密切相关。肉制品中应用的香辛料种类非常多，其中应用于酱卤牛肉生产中的香辛料主要包括花椒、辣椒、丁香、甘草、白芷、陈皮、八角、桂皮、白蔻、小茴香、山萘、草果、香叶等[1,3]。甘草中含有甘草素、甘草苷等二氢黄酮类化合物，这些化合物一般具有甜味[4]；
草果中分离得到表儿茶素、邻苯二酚等多酚类化合物，其中(+)-儿茶素具有苦味和涩味[5]；
辣椒中不仅含有辣椒素、二氢辣椒素，还含有槲皮素等黄酮类物质，而槲皮素具有苦味[6]；
花椒中存在大量的非挥发性苦味化合物，其中对总体风味贡献较大的关键苦味化合物包括槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素、熊果苷、异鼠李素等[7]。有研究者[8,9]建立高效液相色谱方法定量检测花椒中羟基-β-山椒素。也有研究者[10,11]采用反相高效液相色谱法同时测定辣椒中辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素含量，该方法简便快捷，应用该方法测定了10 个品种辣椒中3 个辣椒碱的含量，结果稳定。

前期研究主要集中于酱卤牛肉中的风味物质种类，以及香辛料对肉制品加工品质改善[12,13]、抗菌[14,15]及抗氧化方面[16,17]。然而对香辛料在酱卤牛肉加工过程中赋予牛肉的滋味物质种类及含量尚不明晰，因此无法对酱卤牛肉的滋味进行精准调控。本研究以此为切入点，研究香辛料对酱卤牛肉滋味的赋味效应，实现香辛料的科学复配。基于电子舌（E-tongue）对比单一香辛料与牛后腱肉煮制条件下肉样的滋味变化；
利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS）鉴定复合香辛料提取液、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液、盐水-牛后腱肉煮制提取液中的呈味物质，阐明13 种不同香辛料对酱卤牛肉的赋味效应，为香辛料的科学复配与滋味调控提供技术指导。

1.1 材料与试剂

牛后腱（Beef shank）采自北京卓宸畜牧有限公司经检疫合格、质量约为400 kg 的2 岁龄草原黄牛，屠宰后的牛采用吊挂风冷排酸48 h（循环冷风风速2 m/s、温度0～4 ℃、相对湿度90%），从9 头情况相近的公牛胴体中分别取2 块牛后腱，共52 块肉样，4 ℃保藏以进行后续的试验；
花椒、辣椒、丁香、甘草、白芷、陈皮、八角、桂皮、白蔻、小茴香、山萘、香叶、草果购买自江苏卤江南公司；
甲醇、乙酸锌、亚铁氰化钾、冰乙酸（均为分析纯），购买自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA423S 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；
HH-6 数显恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司；
FW-80 高速万能粉碎机，北京永光明医疗仪器有限公司；
摩尔基因型超纯水器，上海摩勒科学仪器有限公司；
DH-101-3BS 电热恒温鼓风干燥箱，天津市中环实验电炉有限公司；
KQ-500B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；
Allegra X-12 Centrifuge 离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；
RE-2000B 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；
SHZ-Ⅲ循环水真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司；
Microfuge 20R Centrifuge 离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；
Q Exactive Focus 组合四极杆 Orbitrap 质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；
电子舌，法国Alpha MOS 公司。

1.3 方法

1.3.1 电子舌检测

参照田晓静[18]和陶正清[19]的方法，并做适当调整。将42 块肉样随机分为十四组，每组重约600 g。将十四组肉样在同等条件下分别预煮10 min 后捞出。再向每组肉样中加入1.5 L 水、10 g 食盐。将花椒、辣椒、丁香、甘草、白芷、陈皮、八角、桂皮、白蔻、小茴香、山萘、香叶、草果香辛料样品用高速粉碎机粉碎，各取6 g 扎成料包分别加入到十三组肉样中，每组试验组肉样与单一香辛料卤煮40 min，对照组不添加香辛料煮制40 min。试验组与对照组均浸泡90 min 后捞出备用。将上述十四组肉样分别用绞肉机充分搅碎并混合均匀，各称取20 g 于250 mL 的锥形瓶中，每组样品加入200 mL 超纯水于50 ℃下水浴20 min，以10 000 r/min 离心10 min，离心温度为4 ℃，取上清液过滤并将滤液过0.45 μm 的微孔滤膜得电子舌检测液。

1.3.2 牛后腱肉的卤制方法

将10 块肉样随机分为两组，每组约为1 000 g。将两组肉样按照酱卤牛肉的生产工艺，在同等条件下分别预煮10 min 后捞出。对照组再加入2 L 水、17 g食盐卤煮40 min 后浸泡90 min 捞出。试验组加入2 L水、17 g 食盐、按酱卤牛肉中复合香辛料的比例配制的香辛料粉4 包卤煮40 min，浸泡90 min 后捞出。

1.3.3 香辛料样品前处理

参考张洁[20]的方法，并稍加修改。将花椒、辣椒、丁香、甘草、白芷、陈皮、八角、桂皮、白蔻、小茴香、山萘、香叶、草果香辛料样品放入数显鼓风干燥箱于65 ℃干燥4 h，用高速粉碎机粉碎后过60 目筛，每种样品按酱卤牛肉中复合香辛料的比例称取4 份并混合均匀，加入250 mLφ=80%甲醇水溶液、0.5 mL乙酸锌溶液和0.5 mL 亚铁氰化钾溶液，密封后开小孔超声提取2 h，温度为60 ℃。静置10 min 后以10 000 r/min 离心10 min，离心温度为4 ℃。将上清液过滤浓缩定容至50 mL 的容量瓶，用注射器吸取2 mL过0.45 μm 的有机滤膜，于4 ℃下保存备用。

1.3.4 酱卤牛肉样品前处理方法

参考方林明等[21]的方法，并稍加修改。将上述两组肉样分别用绞肉机充分搅碎并混合均匀，称取样品5 g 置于100 mL 的离心管中，加入20 mLφ=80%的甲醇水溶液、0.5 mL 乙酸锌溶液和0.5 mL 亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀。在40 ℃的水浴下超声提取20 min，以10 000 r/min 离心10 min，离心温度为4 ℃。取上清液过滤并转移至50 mL 的烧杯中，沉淀物中再次加入20 mLφ=80%的甲醇水溶液，涡旋混匀，离心10 min，合并上清液并定容至50 mL 的容量瓶中。用注射器吸取2 mL 过0.45 μm 的有机滤膜，于4 ℃下保存备用。

1.3.5 色谱条件

参考Yang 等[7]的方法，并稍加修改。色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；
流动相：A 为φ=0.1%的甲酸和乙腈，B 为φ=0.1%的甲酸水溶液；
洗脱剃度：0～15.0 min，5%～90% B；
1 5.0～2 0.0 m i n，9 0%～9 0% B；
2 0～20.10 min，90%～5% B；
20.10～30 min，5%～5% B；
流量0.3 mL/min；
柱温30 ℃；
进样量5 μL。

1.3.6 质谱条件

参考雒晓梅等[22]的方法，并稍加修改。离子源：电喷雾离子源（ESI）；
鞘气（N2）和辅助气（Ar）流速分别为25 L/min 和8 L/min；
毛细管温度：320 ℃；
喷雾电压：3 800 V（PIM）或-3 400 V（负离子模式）；
扫描模式：Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率70 000，dd-MS2 分辨率17 500，扫描范围：300～1 500，碰撞能量：15、30、45 V。

1.4 数据统计分析

电子舌数据由Microsoft Excel 2019软件处理数据并绘制雷达图，并以“离差平方和法”作为组群合并准则，以“欧式距离”作为度量准则，利用SPSS 20.0 软件进行聚类分析（CA）及差异显著性分析（p＜0.05）。利用Thermo Compound Discover 2.0（CD）分析软件对UPLC-QE 采集的原始数据进行计算，根据OTCM高分辨液质数据库、Chembook 数据库、Chemspider数据库的化合物信息鉴定差异物质。CD 软件可充分利用高保真的Orbitrap 数据来准确鉴定复杂基质中的化合物[22]。所有指标的测定均为3 次平行测定结果。

2.1 香辛料赋予酱卤牛肉的滋味分析

电子舌是一种用于分析滋味物质的有效手段，其具有多种不同类型的传感器，可以模拟人类的味觉感受。在炖煮不同部位牛肉的区分和鉴定[23]、饮料和调味品的品质评价[24,25]、茶叶品质分级[26,27]等方面已有应用。为探究酱卤牛肉加工过程中单一香辛料对牛后腱肉滋味的作用效果，将单一香辛料与牛后腱肉进行煮制，盐水煮制的牛后腱肉作为空白对照，结果如图1 所示。“0～100”的标度是将检测对象的评价指标以酸、甜、苦、鲜、咸五种基本味觉为统一尺度映射后的结果，当标度为25.95 时，可将香辛料分为三类。如图2a 所示，第一类香辛料对甜味和苦味均具有较大的贡献，其中八角、辣椒对甜味的作用效果较为明显，白芷、草果对苦味的作用效果较为明显；
图2b 结果表明，第二类香辛料对酸味、苦味、鲜味、咸味作用效果类似且均不明显，但甘草和桂皮对甜味的贡献比山萘大；
从图2c 可看出第三类香辛料中丁香对甜味的作用效果较为明显，香叶对苦味具有较大的贡献，而小茴香对鲜味具有一定的增益作用。本研究表明香辛料对酱卤牛肉的滋味具有一定的影响，而不同香辛料对酱卤牛肉滋味的作用效果不同，其中甘草、桂皮、八角、辣椒、丁香对甜味的贡献较为突出；
小茴香对鲜味具有一定的增益作用；
而白芷、草果、香叶对苦味的作用效果较为明显。张洁[20]研究了卤鸭脖中单一香辛料和复合香辛料的主效成分，但其并未应用电子舌研究单一香辛料与鸭脖卤制后滋味的变化情况，本实验首次利用电子舌研究单一香辛料与牛后腱煮制后样品的滋味变化，以期更全面的解释不同香辛料对酱卤牛肉的赋味效应。

图1 不同香辛料与牛后腱肉煮制的聚类分析结果Fig.1 Cluster analysis results of different spices cooking with beef shank

图2 单一香辛料对牛后腱肉滋味的影响雷达图Fig.2 The radar map of effects of different spices on the taste of beef shank

已有研究表明草果味微苦、辛辣，白芷味苦，桂皮具有微甜、辛辣的口感，丁香气味强烈芳香、味辛辣，小茴香微甜又略有苦味[28]，而花椒不仅具有特殊的辛香气味，而且辛麻持久，味微甜[29]。甜味是一种受人欢迎的基本味觉，对食品的食用品质和消费者的可接受度都有积极的影响。本研究中对甜味贡献较大的香辛料分别是甘草、桂皮、八角、辣椒和丁香。辣椒作为一种常用的香辛料，其带给人的“辣味”实际上是一种灼烧感，即由神经传递得到的热觉与痛觉的混合[30]。辣椒对甜味的贡献一般源自于辣椒中的氨基酸，Zhang 等[31]在新鲜辣椒中检测到了丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸等甜味氨基酸。辣椒-牛后腱肉煮制后的电子舌检测液由超纯水制备，这些水溶性氨基酸溶解后，在电子舌甜味感受器上有较明显的响应值，因此辣椒对甜味具有贡献，与前人研究结果相一致。甘草、桂皮、丁香等不仅对甜味有突出贡献，其自身还具有一定的抗氧化性，因此在酱卤牛肉加工工艺中，桂皮、甘草等香辛料不仅有助于酱卤牛肉甜味的产生，并且在冷链物流和低温贮藏期间起到保持良好色泽的作用[32,33]；
鲜味作为一种基本味觉，在决定食品可接受性方面起着至关重要的作用[34]。小茴香对鲜味具有一定的增益作用，小茴香中有丰富的氨基酸，其中的谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等具有鲜味[35]，因此在酱卤牛肉加工过程中调节小茴香的添加量有助于在一定程度上增强其鲜味；
食品的苦味通常和毒性相关，一定程度上会对食品的可接受性产生负面的影响，但是苦味物质在抑菌保鲜方面也有一定积极的作用，并且部分消费者对微苦有一定的偏好，因此食品中苦味的平衡至关重要。本研究表明白芷、草果、香叶对酱卤牛肉苦味的作用较为明显，通过调节此类香辛料在复合香辛料中的添加比例，结合消费者的整体偏好，对酱卤牛肉进行精准的滋味调控，满足不同消费者的消费需求。

2.2 香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质分析

香辛料在酱卤牛肉的加工过程中具有不可替代的作用，随着食品科学研究的不断深入，发现香辛料不仅对酱卤牛肉具有品质改善、增香[15]等作用，其在滋味方面的贡献也不可忽视。探究在酱卤牛肉的加工过程中，香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质，首先对复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组、盐水-牛后腱肉煮制提取液组的非挥发性化合物进行解析与鉴定，确定香辛料赋予牛后腱肉的非挥发性化合物。将上述三个处理组的UPLC-MS/MS 结果进行对比，绘制Venn 图。如图3 所示：有139 种化合物在复合香辛料提取液组中检测到而在其他两组中未检出；
有1 种物质在复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液中检测到而在其他两组中未检出，推测这种物质可能是复合香辛料与牛后腱肉煮制的过程中产生的，Wang等[36]研究发现柚皮素、槲皮素等物质的糖苷代谢物在热处理下可转化为相应的苷元和糖体，Toldra[37]研究发现游离氨基酸可以通过Streker 降解、美拉德反应等途径生成挥发性风味物质；
在三个处理组中均能检测到的化合物共10 种，表明这10 种物质在香辛料及牛后腱肉中均存在，例如亮氨酸、胞嘧啶等物质；
有22种化合物为复合香辛料提取液组和复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组所共有，而在盐水-牛后腱肉煮制提取液组中未检出，由此香辛料赋予牛后腱肉的非挥发性化合物共22 种。

图3 复合香辛料提取液、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液、盐水-牛后腱肉煮制提取液中共有和独特物质的数量的Venn 图Fig.3 Venn diagram for numbers of shared and unique compounds among the extraction of mixed spice,extraction of beef shank stewed in mixed spice and extraction of beef shank stewed in salt water

2.3 香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质鉴定

根据OTCM 高分辨液质数据库、Chembook 数据库、Chemspider 数据库的化合物信息鉴定，确定香辛料提取液组与复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组、盐水-牛后腱肉煮制提取液组共鉴定到174 种非挥发性化合物，如表1 所示。其中黄酮类化合物共60 种，香豆素类化合物共19 种，生物碱类化合物共18 种，萜类化合物共16 种，酚及酚酸类化合物15 种，有机酸类化合物共12 种，其他种类化合物较少。黄酮类化合物是香辛料中广泛存在的一种物质，通常具有抗氧化、抗菌、抗炎等作用[38],目前某些黄酮类化合物已经作为一种新型甜味剂应用到食品加工中，例如，二氢查尔酮具有甜味大、性质稳定、口感清爽等优点，已应用于口香糖、糖果等食品的加工工艺中[39]；
生物碱类化合物主要存在于椒类香辛料中，如辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素等；
酚类化合物大多与单糖或者多糖结合形成糖苷，以结合态存在[40]；
其他种类化合物主要为香辛料中易挥发性成分，可赋予酱卤牛肉独特的风味，例如桂皮中的肉桂醛具有特殊的肉桂香味。

表1 复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组、盐水-牛后腱肉煮制提取液中非挥发性物质鉴定Table 1 Identification of non-volatile substances in the extraction of mixed spice,extraction of beef shank stewed in mixed spice and extraction of beef shank stewed in salt water

续表1

续表1

续表1

通过差异分析确定香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性化合物共22 种，如表2 所示。其中黄酮类化合物共16 种，包括槲皮甙、异橙黄酮、新橙皮甙、柚皮素、柚皮苷、甘草苷元-7-O-β-D-芹糖-4"-O-β-D-葡萄糖苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草苷、异甘草苷、甜橙黄酮、异槲皮苷、圣草次苷、桔皮素、川陈皮素、紫云英苷；
酮类化合物2 种，包括花椒油素、乙酰苯；
酯类化合物、生物碱类化合物、香豆素类化合物、有机酸类化合物各1 种，分别是对甲氧基肉桂酸乙酯、木兰花碱、佛手酚、对羟基肉桂酸。通过检索OTCM 高分辨液质数据库、Chembook 数据库、Chemspider 数据库，确证了香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质共8 种，其中新橙皮苷、甘草苷、乙酰苯具有甜味；
柚皮苷、异槲皮苷、桔皮素、川陈皮素、紫云英苷具有苦味。与电子舌样品前处理方法相比，UPLC-MS/MS 样品前处理时复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液由80%甲醇溶液制备，因此未检测到呈甜味及鲜味的氨基酸，两者结果并不冲突。

表2 复合香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质鉴定Table 2 The identification of the non-volatile substance difference in the sauced beef with different spices

2.4 香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质差异分析

热图可以通过颜色的深浅来直观的反映某种非挥发性化合物的含量变化，因此依据三个处理组中22种非挥发性化合物的峰面积绘制热图，结果如图4 所示。图中红色表示高表达，蓝色表示低表达。从图中条带可看出，22 种非挥发性化合物在不同处理组中都有明确的高表达或低表达区域，这些差异物质在复合香辛料提取液组中含量明显较高，在复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组中含量较低，在盐水-牛后腱肉煮制提取液中未检出。

图4 不同处理组非挥发性物质的聚类热图Fig.4 Clustering heatmap of non-volatile compounds in different treatment groups

香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质包括黄酮类物质、香豆素类物质和生物碱类物质。郑洁[41]等用超高效液相色谱法测定了柑橘中的酚酸和黄酮类化合物，其在不同品种，不同部位的柑橘中含量差异较大。不同的香辛料赋予酱卤牛肉的黄酮类化合物包括柚皮苷、新橙皮苷、陈皮苷、槲皮甙、甘草苷、芸香柚皮苷、异橙黄酮和紫云英苷等，其中大多数具有苦味，但新橙皮苷在氢化作用下可转化为新橙皮苷二氢查尔酮，甜度为蔗糖的950 倍，且回味无苦味，可直接应用于各种食品中[39]，因此黄酮类化合物是香辛料赋予酱卤牛肉的不可忽视的一类物质；
香豆素的化学名称为12-苯并吡喃酮，是自然界中广泛存在的一种内酯类化合物，其在酸性条件下结构稳定，碱性条件下易开环。香豆素类化合物被广泛应用于香精香料以及食品添加剂中，但过量的香豆素类物质对肝肾具有毒害作用[42]，食品中最高用量为5 mg/kg。徐建军[43]等采用HPLC-MS/MS 法在枳壳朴汤冻干粉中也测定到了佛手酚，结果表明香豆素类化合物在枳壳朴汤冻干粉中含量较低。由表1 可知，佛手酚在酱卤牛肉中的含量也较低，推测香豆素类化合物在热加工过程中内酯环水解开裂，导致了其含量的降低；
生物碱类化合物是存在于自然界（主要为植物）中的一类含氮的碱性有机化合物，在其生物合成途径中氨基酸是起始物，主要发生环合反应和碳-氮键的裂解，因此生物碱类化合物总有一些相似的性质[44]。本研究在香辛料和酱卤牛肉中均检出了木兰花碱，其具有良好的抗心律失常[45]、抗炎[46]、抗氧化[47]及抗菌活性[48]等作用。辣椒碱是辣椒的主要成分，具有辛辣刺激的口感，在UPLC-MS/MS 结果中未检出辣椒碱可能是由于辣椒在复合香辛料中的添加比例较低，因此辣椒碱含量低于检出限。

本研究采用电子舌和UPLC-MS-MS 技术，结合OTCM 高分辨液质数据库、Chembook 数据库、Chemspider 数据库，对13 种香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质进行了解析。结果表明香辛料能赋予酱卤牛肉不同的滋味，主要包括甜味，鲜味和苦味，不同香辛料对酱卤牛肉滋味的作用效果不同，其中甘草、桂皮、八角、辣椒和丁香对甜味贡献突出；
小茴香对鲜味具有增益作用；
白芷、草果和香叶对苦味作用效果较大；
复合香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质有8 种，其中新橙皮苷、甘草苷、乙酰苯具有甜味，柚皮苷、异槲皮苷、桔皮素、川陈皮素、紫云英苷具有苦味，复合香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质主要为黄酮类化合物。本研究阐明了13 种不同香辛料对酱卤牛肉的赋味效应，明确了复合香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质种类，为香辛料的科学复配与滋味调控提供技术指导。