羟尼酮可阻止大鼠肝星状细胞活化：基于抑制TGF-β1通路蛋白的磷酸化

赵治彬，董 辉，李兵航，沈 波，郭悦承，顾天翊，曲 颖，蔡晓波，陆伦根

1南京医科大学附属上海一院临床医学院消化科，上海 200080；
2江苏省泰州市人民医院消化科，江苏 泰州225300

肝纤维化指肝脏细胞外基质过度沉积和异常分布，是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤，研究显示肝纤维化是可以逆转的［1-2］。肝星状细胞在肝纤维化的发生发展中起到重要作用［3-4］。目前尚无批准用于临床的抗肝纤维化药物。吡非尼酮已批准用于特发性肺纤维化的治疗［5-6］，羟尼酮是吡非尼酮的衍生物，羟尼酮能够有效抑制P38γ和葡萄糖激酶（GCK）基因，而P38γ和GCK基因是TGF-β信号转导通路上的两个重要激酶，抑制TGF-β被认为是抑制胶原蛋白产生和蓄积（纤维化）的最重要信号转导通路之一。本研究探讨羟尼酮对CCl4诱导的肝纤维化的作用及相关机制。

1.1 实验动物与材料

雄性SD大鼠（体质量180～200 g）购自上海维通利华实验动物技术有限公司，四氯化碳（上海青峰生物科技有限公司），羟尼酮、吡非尼酮（北京康蒂尼药业股份有限公司），羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所），抗α-SMA抗体（19245）、抗Smad3抗体（9523T）、抗磷酸化Smad3抗体（9520T）、抗p38抗体（9212）、抗磷酸化p38抗体（4631S）、抗Erk 1/2抗体（4695T）、抗磷酸化Erk 1/2 抗体（4377T）、抗Akt 抗体（4691T）、抗磷酸化Akt抗体（4058S）（CST），抗I 型胶原蛋白抗体（ab260043）（Abcam）。

1.2 动物处理

所有动物实验已通过上海市第一人民医院（南京医科大学附属上海一院临床医学院）动物伦理委员会批准。66只雄性SD大鼠饲养于SPF级动物房中，按随机数字法分为对照组10只、模型组20只、羟尼酮（100 mg/kg）组12 只、羟尼酮（250 mg/kg）组12 只和吡非尼酮（250 mg/kg）组12只。采用CCl4皮下注射进行肝纤维化造模，对照组：腹腔注射橄榄油溶液（2 mL/kg），模型组：腹腔注射50%CCl4溶液（橄榄油制成，2 mL/kg），羟尼酮（100 mg/kg）组：腹腔注射50%CCl4溶液（橄榄油制成，2 mL/kg），羟尼酮（250 mg/kg）组：腹腔注射50% CCl4溶液（橄榄油制成，2 mL/kg），吡非尼酮（250 mg/kg）组：腹腔注射50%CCl4溶液（橄榄油制成，2 mL/kg），2次/周，连续12周。从造模后第7周开始，羟尼酮（100 mg/kg）组、羟尼酮（250 mg/kg）组及吡非尼酮（250 mg/kg）组大鼠分别予以相应剂量的羟尼酮、吡非尼酮（以0.5%羧甲基纤维素钠溶解）灌胃给药，其余两组大鼠予以0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，1次/d，连续6周。于末次给药后24 h，采用脊椎脱臼法处死大鼠，心脏取血，分离血清，每只大鼠留取同一部位肝组织，10%福尔马林固定，其余肝组织于-70 ℃保存待测。肝纤维化造模成功的标准：大鼠精神萎靡、进食下降，活动减少，生化指标表现为肝脏组织羟脯氨酸升高，病理表现为肝小叶结构破坏、纤维组织增生、假小叶形成。

1.3 肝功能测定

使用全自动生化分析仪检测大鼠血清肝功能，包括总胆红素（TBIL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移膜（AST）。

1.4 肝脏羟脯氨酸测定

按照羟脯氨酸试剂盒说明书操作，检测肝脏组织羟脯氨酸的含量。

1.5 肝组织病理学检查

10%福尔马林固定的肝组织，经过脱水、透明、石蜡包埋后，以4 μm厚度切片，分别进行苏木精-伊红（HE）染色和Sirius Red染色，然后在光镜下进行观察，采用Ishak评分系统［7］对炎症和纤维化程度分别进行评分。

1.6 细胞培养和处理

人肝星状细胞系LX-2 使用含10%胎牛血清的DMEM溶液作为培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。首先将细胞分为六组测定α-SMA、I型胶原蛋白：对照组、TGF-β组、羟尼酮50 μmol/L组、羟尼酮100 μmol/L组、羟尼酮200 μmol/L 组、吡非尼酮200 μmol/L 组。LX-2 细胞接种在六孔板中，每孔10000 细胞，加入DMEM完全培养基，使细胞融合度达到60%～70%后，换无血清的DMEM 同步化培养24 h，随后分别加入TGF-β1（终浓度5 ng/mL）和不同浓度的药物，培养48 h后收取总蛋白。接着将细胞分为4组测定TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白：对照组、TGF-β组、羟尼酮200 μmol/L组、吡非尼酮200 μmol/L组。LX-2细胞接种在六孔板中，10 000/孔，加入DMEM完全培养基，使细胞融合度达到60%～70%后，换无血清的DMEM 同步化培养24 h，随后加入药物培养24 h，在收取总蛋白前15、30、60 min加入TGF-β1（终浓度5 ng/mL）。

1.7 Western blot

细胞经过RIPA裂解后，用BCA法测定蛋白质浓度，调整各组蛋白质浓度达到均一，加入蛋白上样缓冲液，放入100 ℃水浴锅中煮10 min。取20 μg蛋白加样到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白，然后转膜至聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶（磷酸化蛋白使用5%牛血清白蛋白）室温下封闭1 h，TBST洗涤3次，每次5 min，加入第一抗体，在4 ℃摇床上孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，加入第二抗体，室温孵育1 h，加上电化学发光液，在GE显影仪中显影。

1.8 统计学方法

用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，组间数据两两比较LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 羟尼酮对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的治疗作用

各组大鼠肝功能的结果比较：模型组大鼠的ALT、AST、TBIL均明显高于对照组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。羟尼酮（250 mg/kg）组大鼠的TBIL值低于模型组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。羟尼酮（100 mg/kg）组大鼠、羟尼酮（250 mg/kg）组大鼠、吡非尼酮（250 mg/kg）组大鼠的ALT、AST与模型组大鼠相比，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 各组大鼠的肝功能比较Tab.1 Comparison of liver function among the groups(Mean±SD)

各组大鼠肝组织羟脯氨酸含量的比较：模型组大鼠的肝组织羟脯氨酸含量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。羟尼酮（100 mg/kg）组大鼠、羟尼酮（250 mg/kg）组大鼠的肝组织羟脯氨酸含量低于模型组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。吡非尼酮（250mg/kg）组大鼠的肝组织羟脯氨酸含量与模型组大鼠相比，差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 各组大鼠肝组织羟脯氨酸含量的比较Tab.2 Hydroxyproline content in the liver tissues of the rats in each group(Mean±SD)

各组大鼠的肝组织病理学改变正常组大鼠的肝组织镜下见以肝小叶中央静脉为中心呈放射样排列（图1A、图2A）。模型组大鼠的肝组织镜下可见大量胶原沉积，形成纤维隔，并相互连接形成结节状假小叶，有空泡变性、炎性细胞浸润、肝小胆管增生或变性和肝细胞坏死（图1B、图2B）。羟尼酮（100 mg/kg）组大鼠、羟尼酮（250 mg/kg）组大鼠的肝组织病变程度轻，中央静脉周围坏死和纤维化范围小，窦周纤维化程度轻，伴少量纤维间隔（图1C、D、图2C、D）。吡非尼酮（250 mg/kg）组大鼠的肝组织镜下也可见较多的纤维间隔（图1E、图2E）。

图1 各组大鼠的肝组织病理学改变Fig.1 Histopathological changes of the liver in each group (HE staining,original magnification:×50).A: Control group.B:Model group.C:Hydronidone(100 mg/kg)group.D:Hydronidone(250 mg/kg)group.E:Pirfenidone(250 mg/kg)group.

图2 各组大鼠的肝组织病理学改变Fig.2 Histopathological changes in the liver of the rats in each group (Sirius Red staining,×50).A: Control group.B: Model group.C:Hydronidone(100 mg/kg)group.D:Hydronidone(250 mg/kg)group.E:Pirfenidone(250 mg/kg)group.

各组大鼠肝组织炎症和纤维化评分的比较：模型组大鼠肝组织炎症评分明显高于对照组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01），羟尼酮（100 mg/kg）组、羟尼酮（250 mg/kg）组、吡非尼酮（250 mg/kg）组大鼠的肝组织炎症评分均低于模型组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。模型组大鼠肝组织纤维化评分明显高于对照组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01），羟尼酮（100 mg/kg）组、羟尼酮（250 mg/kg）组大鼠的肝组织纤维化评分低于模型组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.05），而吡非尼酮（250 mg/kg）组大鼠的肝组织纤维化评分与模型组大鼠相比，差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 各组大鼠肝组织炎症和纤维化评分的比较Tab.3 Comparison of liver inflammation and fibrosis scores among the groups(Mean±SD)

2.2 体外细胞实验探讨羟尼酮治疗肝纤维化的分子机制

各组细胞α-SMA和I型collagen蛋白的比较：对照组细胞的α-SMA和I型collagen蛋白水平最低，TGF-β1组细胞表达此两种蛋白的水平最高，羟尼酮50 μmol/L组细胞、羟尼酮100 μmol/L组细胞和羟尼酮200 μmol/L组细胞表达这两种蛋白的水平较TGF-β1组降低，且随羟尼酮浓度升高，两种蛋白的表达水平逐渐降低。吡非尼酮200 μmol/L组细胞表达两种蛋白的水平较TGF-β1组细胞也有所下降（图3）。

图3 各组细胞表达α-SMA和I型collagen蛋白的比较Fig.3 Expression levels of α-SMA and collagen type I proteins in each group.*P＜0.05 vs control group,#P＜0.05 vs TGF-β group.

不同作用时间下的各组细胞表达TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的水平比较：对照组细胞表达TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的水平最低。TGF-β1刺激细胞后，TGF-β1组细胞、羟尼酮200 μmol/L组细胞和吡非尼酮200 μmol/L组细胞的TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的表达水平随着作用时间的延长而增加，但在相同的作用时间下，羟尼酮200 μmol/L组细胞与吡非尼酮200 μmol/L组细胞TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的表达水平均低于TGF-β1组细胞（图4）。

图4 不同作用时间下各组细胞表达TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的水平比较Fig.4 Comparison of expression levels of phosphorylated proteins in TGF-β signal pathway among the groups with different treatment time.*P＜0.05 vs control group,#P＜0.05 vs TGF-β group.

肝纤维化是各种致病因素导致的肝脏弥漫性细胞外基质（ECM）过度沉积的结果，持续的慢性肝细胞炎症可以使肝纤维化进展为肝硬化甚至是肝癌，研究表明肝纤维化可以逆转［8,9］。有研究发现，针对病因治疗可以部分逆转肝纤维化进展［10-13］，但目前尚没有针对肝纤维化的有效药物。吡非尼酮具有抗肺纤维化的作用，但是对肝纤维化的治疗作用有待进一步证实［5,6］。本研究旨在研究吡非尼酮的新型衍生物羟尼酮对CCl4引起的大鼠肝纤维化模型的作用和相关机制。常用的肝纤维化造模方法有化学法、免疫法、饮食法、手术、遗传修饰等，与其他造模方法相比，CCl4造模法具有成功率高、造模时间短，适用于大批量制作肝纤维化模型，故本实验采用CCl4方法进行造模。

羟脯氨酸是胶原组织的主要成分之一，本研究结果显示：模型组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量较对照组大鼠明显升高，羟尼酮组大鼠肝组织羟脯氨酸含量较模型组大鼠下降，吡非尼酮组大鼠肝组织羟脯氨酸含量无明显下降。肝组织病理学评分结果显示，羟尼酮组大鼠炎症损伤和纤维化程度均有好转，吡非尼酮组大鼠炎症损伤有所改善，但纤维化程度无缓解。上述结果表明羟尼酮能够治疗CCl4诱导的大鼠肝纤维化，且治疗作用强于吡非尼酮。

肝纤维化的病理变化起始于肝星状细胞（HSC）的活化，正常肝脏中，HSC处于静止状态，合成胶原的能力很低［14］。当肝细胞受到损伤时，多种细胞因子被分泌，如转化生长因子β（TGF-β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、胰岛素生长因子（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板源性生长因子（PDGF）等，这些细胞因子活化HSC，使之出现肌成纤维母细胞样表型转化，导致细胞增殖、纤维化以及肝脏细胞外基质（ECM）合成增加等，ECM蛋白包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA，这些蛋白质被认为是肝星状细胞活化和肝纤维化的标志物［15］。本研究的细胞实验结果显示，TGF-β1组细胞表达α-SMA和Ⅰ型collagen蛋白较对照组细胞升高，羟尼酮组细胞表达这两种蛋白的水平较TGF-β1组细胞下降，而且呈现一定的量效关系，说明羟尼酮能够抑制肝星状细胞的活化。

在刺激HSC活化的细胞因子中，TGF-β的作用是最重要的，是目前已知最强烈的纤维化促进因子，在TGF-β的信号转导传导通路中，涉及到多种蛋白的磷酸化，包括Smad3、P38、ERK、Akt等，其中Smad3是TGF-β的信号传导的重要分子［16-21］。本研究分析比较了不同作用时间下的各组细胞表达TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的水平，结果显示，对照组细胞表达TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的水平最低，TGF-β1刺激细胞后，TGF-β1组细胞、羟尼酮200 μmol/L组细胞和吡非尼酮200 μmol/L组细胞的TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的表达水平随着作用时间的延长而增加，但在相同的作用时间下，羟尼酮200 μmol/L组细胞与吡非尼酮200 μmol/L组细胞TGF-β信号转导通路磷酸化蛋白的表达水平均低于TGF-β组细胞，说明羟尼酮可以抑制TGF-β信号转导通路蛋白磷酸化。

综上所述，羟尼酮可显著抑制TGF-β信号转导通路蛋白的磷酸化，从而阻止TGF-β1介导的肝星状细胞活化，可能是其缓解CCl4诱导的大鼠肝纤维化机制之一。