miR-183-5p通过靶向调控FAT1抑制胃癌进展*

王娅南， 魏亚宁， 范翔宇， 张 培， 王 盼， 李靖华

河北大学附属医院 1病理科 2肿瘤内科 3外科，保定 071000

胃癌(gastric cancer，GC)是最常见恶性肿瘤之一。虽然近年来外科手术、放疗、化疗和分子靶向治疗在诊治GC上取得了较大的进展，但GC患者在确诊后生存期仍然较短，其中晚期患者的5年生存率为5%～20%，中位生存期不到1年[1-4]。由于GC临床表现不具有特异性，故早期诊断和干预对改善和延长GC患者生存期具有重要意义。因此深入探寻GC发生的潜在机制将有助于寻找新的诊断生物标志物和有效的治疗干预措施。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA。miRNA通过与其靶点信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻译区(3′UTR)的不完全碱基配对来调节蛋白质表达[5]。研究发现一些miRNA在GC发生和发展过程中呈现出正向或者负向调节作用[6-10]。miR-183-5p是一种癌症相关的miRNA，参与调节骨肉瘤、肝癌和肺癌等多种恶性肿瘤的进展[11-14]。有研究报道miR-183-5p参与调节GC细胞的迁移和侵袭[15]，提示其在GC的发生发展中发挥重要作用。本研究观察miR-183-5p在GC组织和细胞的表达水平，初步探讨miR-183-5p对GC生物学行为的影响及其潜在的分子机制，为GC临床诊断和治疗提供一个潜在的生物学靶点。

1.1 临床资料

收集2018年5月至2020年5月在河北大学附属医院接受胃切除术的66例经内镜活检并行术后病理检查的GC确诊患者。所有患者或其亲属都签署了知情同意书。本研究经河北大学附属医院伦理委员会批准。GC患者手术前未接受局部或全身放疗或化疗。肿瘤组织和癌旁组织收集后，冷冻并储存在液氮(-196℃)中备用。

1.2 细胞株及转染

人GC细胞株(AGS、BGC-823、MKN45、SGC-7901)和人正常胃上皮细胞株GES-1购自美国典型培养物保藏中心(美国ATCC)。所有细胞培养均在含10%胎牛血清(美国HyClone公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/ mL链霉素(美国Invitrogen公司)的DMEM培养液中进行培养。构建的慢病毒载体转染BGC-823细胞，包括LV2-has-miR-183-5p和LV2空白慢病毒构建载体(阴性对照，上海吉玛制药技术有限公司)。在含有5 μg/mL嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)的培养物中筛选稳转细胞。

1.3 miRNA靶点预测

使用在线工具TargetScan(http：//www.targetscan.org/)和miRanda(http：//www.microrna.org/)对miR-183-5p靶点进行预测和分析。

1.4 荧光素酶报告基因测定

非典型FAT钙粘蛋白1(FAT1)野生型3′-UTR序列与预测目标位点内miR-183-5p或突变序列相互作用合成并插入pGL3对照载体(美国Promega公司)。BGC-823细胞接种在24孔板中，采用上述构建体和miR-183-5p/对照载体转染。48 h后收集细胞并使用双荧光素酶报告基因测定系统(美国Promega公司)测量荧光素酶活性。

1.5 qRT-PCR法检测基因表达水平

使用TRIzol©试剂(美国赛默飞世尔科技公司)从组织或者细胞系中提取总RNA。使用cDNA合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA。然后基于TaqMan miRNA检测试剂盒(美国Applied Biosystems)在ABI7900实时PCR系统中通过miR-183-5p特异性引物对miR-183-5p进行定量检测。使用引物试剂盒(TaKaRa，大连，中国)合成FAT1的cDNA，使用实时PCR定量系统检测FAT1 mRNA水平。GAPDH和U6分别为mRNA和miRNA的内标。

1.6 细胞增殖和凋亡检测

将2×104个BGC-823细胞或转染后BGC-823细胞种植于96孔板中，分别设为对照组(BGC-823细胞)、空白转染对照组(空白载体转染的BGC-823细胞)、miR-183-5p转染组(miR-183-5p转染的BGC-823细胞)，各组细胞孵育特定时间(0～72 h)。培养结束前4 h，将10 μL MTT(美国Sigma公司)溶液加入每个孔中，继续孵育4 h。酶标仪测量490 nm处的吸光度值。将1×105个BGC-823细胞或转染后BGC-823细胞种植于6孔板中。细胞培养48 h后离心弃去细胞培养液，经PBS洗涤后，使用碘化丙啶(PI，10 μg/mL，美国Sigma公司)和Annexin Ⅴ-FITC(50 μg/mL，美国BD Biosciences公司)对细胞进行双染。采用FACScan流式细胞仪(美国Beckman Coulter)检测细胞凋亡水平。

1.7 蛋白免疫印迹法检测

使用蛋白提取试剂盒(中国碧云天试剂有限公司)从细胞或组织中提取总蛋白。采用BCA试剂盒(中国碧云天试剂有限公司)对蛋白浓度进行定量。取约20 μg蛋白质提取物，在10% SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜封闭并与FAT1一抗(英国Abcam公司)在4℃下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗(中国碧云天试剂有限公司)在室温下孵育1 h。使用PierceTMECL蛋白质印迹底物(美国赛默飞世尔科技公司)对蛋白条带进行可视化。使用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析。

1.8 免疫组织化学染色

将患者组织标本固定，包埋在石蜡中，然后制备组织切片。将5 μm厚的组织切片进行脱蜡、脱水并在柠檬酸盐缓冲液中加热15 min。将组织切片先与FAT1抗体4 ℃下孵育过夜，然后与二抗继续孵育2 h。使用DAB试剂盒(中国碧云天试剂有限公司)对切片进行显色。

1.9 小鼠移植瘤模型

6周龄雄性BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物实验按照河北大学动物实验伦理委员会的指导方针进行。分别将5×106个BGC-823细胞、空白转染的BGC-823细胞、miR-183-5p稳定转染的BGC-823细胞注射植入裸鼠腋窝皮下部位。每4天测量1次肿瘤长度(L)和宽度(W)。肿瘤体积计算公式：V=0.5×L×W2。造模后第24天，处死小鼠并剥离肿瘤组织。采用4%多聚甲醛将肿瘤组织进行固定后，进行下一步研究。

1.10 TUNEL检测

小鼠肿瘤组织经石蜡包埋并切片(5 μm)后，使用TUNEL凋亡检测试剂盒(南京凯基生物技术)检测肿瘤组织中的细胞凋亡水平。采用共聚焦显微镜(德国徕卡公司)观察组织切片的凋亡水平，在5个随机视野(×200)下对组织标本中凋亡细胞数和细胞总数进行计数。凋亡率=凋亡细胞/总细胞×100%。

1.11 统计学方法

2.1 GC肿瘤组织和细胞株中miR-183-5p水平下调

与癌旁组织相比，GC肿瘤组织miR-183-5p水平显著降低(图1A，P<0.01)。与GES-1相比，GC细胞株(AGS、BGC-823、MKN45和SGC-7901)miR-183-5p水平均显著降低(图1B，均P<0.01)。miR-183-5p水平与肿瘤大小(图1C)、GC肿瘤分型(肠型7.72vs.弥漫型3.85，P<0.01)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期7.2vs.Ⅲ+Ⅳ期4.4，P<0.05)、生存时间(图1D)呈负相关。

A：GC组织miR-183-5p水平，**P<0.01；
B：GC细胞株(MKN45、BGC-823、SGC-7901、AGS)和正常胃上皮细胞(GES-1)miR-183-5p水平，**P<0.01；
C：miR-183-5p与肿瘤大小的相关性分析，n=66；
D：GC患者生存时间Kaplan-Meier曲线，n=66图1 GC肿瘤组织和细胞miR-183-5p水平下调Fig.1 Downregulation of miR-183-5p levels in GC tissues and cells

2.2 miR-183-5p抑制BGC-823细胞增殖

基于miR-183-5p在BGC-823细胞表达水平最低，转染实验选择BGC-823细胞进行。如图2A所示，qRT-PCR确认了miR-183-5p转染效率。与空白转染对照组比较，miR-183-5p转染组miR-183-5p水平显著上调(P<0.01)。如图2B、2C所示，与空白转染对照组比较，miR-183-5p转染组细胞增殖能力降低，凋亡水平显著升高(均P<0.01)。

A：BGC-823细胞转染miR-183-5p；
B：miR-183-5p对BGC-823细胞增殖的影响；
C：miR-183-5p对BGC-823细胞凋亡的影响；
与空白转染对照组比较，**P<0.01图2 miR-183-5p抑制BGC-823细胞增殖Fig.2 miR-183-5p inhibits BGC-823 proliferation

2.3 FAT1是miR-183-5p的靶标

使用在线预测工具TargetScan和miRanda搜索miR-183-5p目标mRNA。因为FAT1具有miR-183-5p潜在的结合位点(图3A)，故选择FAT1作为潜在靶标进行实验验证。如图3B所示，转染miR-183-5p后，BGC-823细胞中FAT1表达水平显著降低(P<0.01)。将带有野生型和突变型miR-183-5p结合位点的3′-UTR FAT1片段克隆到pmirGLO双荧光素酶载体中。如图3C所示，荧光素酶活性测定结果表明在转染miR-183-5p的BGC-823中野生型FAT1 3′UTR报告基因活性受到明显抑制(P<0.01)，但对突变型FAT1无抑制作用。

1：空白转染对照组；
2：miR-183-5p转染组；
A：预测的miR-183-5p靶序列；
B：BGC-823过表达miR-183-5p对FAT1表达的影响；
C：转染细胞荧光素酶活性；
与空白转染对照组比较，**P<0.01图3 FAT1是miR-183-5p的直接靶标Fig.3 FAT1 is a direct target of miR-183-5p

2.4 GC肿瘤组织和细胞株中FAT1表达水平上调

如图4A所示，与癌旁组织比较，肿瘤组织中FAT1 mRNA水平显著升高(P<0.01)。如图4B所示，免疫组织化学染色结果显示肿瘤组织FAT1蛋白表达水平显著高于癌旁组织。如图4C所示，Spearman相关性分析结果表明GC组织中miR-183-5p水平与FAT1水平呈现负相关(rs=-0.2577，P=0.0367)。如图4D所示，与GES-1细胞相比，GC细胞株MKN45、BGC-823、SGC-7901、AGS中FAT1表达水平均显著上调(均P<0.01)。

A：GC肿瘤组织FAT1转录水平；
B：免疫组化检测GC肿瘤组织FAT1表达水平；
C：GC肿瘤组织miR-183-5p和FAT1水平相关性分析；
D：Western blot检测GC细胞株(MKN45，BGC-823，SGC-7901，AGS)和正常胃上皮细胞(GES-1)的FAT1表达水平；
与癌旁组织比较，##P<0.01；
与GES-1细胞比较，**P<0.01图4 GC肿瘤组织FAT1水平上调且与miR-183-5p表达呈负相关Fig.4 The level of FAT1 in GC tissues is upregulated and negatively correlated with miR-183-5p

2.5 miR-183-5p抑制GC移植瘤模型生长

将转染不同载体的BGC-823细胞注射到裸鼠的腋窝皮下部位，考察肿瘤形成大小。如图5A所示，与空白转染对照组比较，miR-183-5p转染组肿瘤体积明显减小(均P<0.01)。如图5B所示，与空白转染对照组比较，miR-183-5p转染组肿瘤组织TUNEL阳性率显著升高，凋亡水平显著增加(P<0.01)。如图5C所示，与空白转染对照组比较，miR-183-5p转染组肿瘤组织FAT1表达水平显着下调(P<0.01)。

1：对照组；
2：空白转染对照组；
3：miR-183-5p转染组；
A：BGC-823移植瘤模型肿瘤体积；
B：TUNEL法检测肿瘤组织凋亡水平；
C：Western blot检测肿瘤组织FAT1表达水平，n=6；
与空白转染对照组比较，**P<0.01图5 miR-183-5p抑制BGC-823移植瘤的生长Fig.5 miR-183-5p inhibits the growth of BGC-823 xenograft tumor model

miRNA在恶性肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用[5]。研究表明miRNA水平异常在GC进展中起关键作用[6-10]。miR-183是一种癌症相关的miRNA[16]，在多种恶性肿瘤中存在着异常表达[11-14]。本研究初步考察GC患者、GC细胞系miR-183-5p的表达情况，结果发现GC肿瘤组织miR-183-5p水平显著低于癌旁组织，AGS、BGC-823、MKN45和SGC-7901中miR-183-5p水平也明显低于GES-1细胞株。相关性分析结果表明miR-183-5p表达水平与GC分型、肿瘤组织大小、TNM分期和患者生存时间存在显著的负相关，提示miR-183-5p参与了GC的发生和发展。已有研究报道miR-183-5p参与调节GC细胞的迁移和侵袭，因此为了进一步揭示miR-183-5p在GC中精确的生物学功能，本研究观察了转染miR-183-5p的GC细胞的增殖和凋亡水平变化。结果表明，过表达miR-183-5p抑制GC细胞增殖并促进其凋亡。与体外研究结果相一致，在BGC-823移植瘤小鼠模型中，转染miR-183-5p能够显著抑制BGC-823在裸鼠体内的恶性生长。当前研究结果提示miR-183-5p是GC发展过程中重要的负性调节因子。

已有研究报道PTEN、PIK3CA、ITGB1是miR-183-5p的靶标[17-19]。为了进一步阐明miR-183-5p通过何种途径抑制GC的进展，本研究基于开放的在线预测工具TargetScan和miRanda初步预测FAT1可能是miR-183-5p的作用靶点之一，并通过荧光素酶报告基因法对该靶标的有效性进行了验证。FAT1基因与人类癌症具有密切的联系，在恶性肿瘤中发挥着双面角色的作用，在不同的肿瘤中同时具有致癌和抗癌作用。研究发现导管癌发展为浸润性导管癌过程中存在着FAT1缺失；
体外降低FAT1表达可以增加食管鳞状细胞的增殖、迁移和侵袭能力[20-21]。与原代肝细胞和非肿瘤肝组织相比，人类肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)肿瘤组织中FAT1表达增加[22]，而降低FAT1表达水平可以抑制HCC细胞的增殖和迁移能力。此外，研究发现FAT1参与调节恶性肿瘤的发展可能与其调节MAPK/ERK信号通路有关[23]。本研究首次发现，与对照组比较，GC肿瘤组织和细胞株AGS、BGC-823、MKN45和SGC-7901中FAT1水平显著升高，且GC肿瘤组织中FAT1水平与miR-183-5p水平呈现负相关，提示miR-183-5p发挥肿瘤抑制功能与降低FAT1表达有关。

综上所述，生物信息学工具TargetScan和miRanda预测miR-183-5p潜在靶标是FAT1。本研究发现miR-183-5p在GC肿瘤组织中表达水平下调，且与GC进展和预后存在密切的联系。此外，miR-183-5p在GC肿瘤恶性生长中发挥负性调节作用，这一功能可能与靶向调控FAT1水平有关。miR-183-5p有望成为GC潜在的诊断和治疗靶点。