红景天苷对DCM大鼠血清中HIF-1α、ET-1、PⅠP、醛固酮的影响*

孙 文 谢春毅 何德英 米 虹

(1.重庆市中医院老年病科，重庆 400016；
2.上海市中西医结合医院心内科，上海 200082；
3.重庆市中医院中医经典科，重庆 400016)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM) 是一种由高血糖和胰岛素抵抗引起的心肌结构和功能改变的原发性、特异性心肌病[1]。目前，DCM尚无统一的诊断标准，是指排除高血压病、冠状动脉疾病和瓣膜病变等器质性心脏疾病以外的糖尿病人群中的心室舒张和(或)收缩功能障碍的一种心肌病[2]，主要临床表现为心律失常、心脏扩大、心力衰竭甚至猝死等。红景天苷是自中药红景天中提取的主要有效成分，是一种苯乙醇类化合物，红景天苷具有促进血管再生、抑制心肌细胞凋亡、改善心肌缺血及抗氧化[3]等作用。本研究通过红景天苷不同剂量干预DCM大鼠，并与曲美他嗪相比较，分析红景天苷对DCM大鼠血清指标的影响，并与传统改善心肌能量代谢的药物曲美他嗪进行对比，现报道如下。

1.1 实验动物 SPF级成年雄性SD大鼠40只，体质量为(200±20)g，由中国科学院上海实验动物中心提供[动物许可证编号：SCXK(沪)2008—2002]，所有大鼠均在相同标准环境(GB14925—2001)内饲养(上海中医药大学动物实验中心)，予人工光照(明暗各12 h)及自由饮水，高糖高脂饲料喂养于糖尿病大鼠专用铁丝饲养箱，饲养室保持恒温恒湿(温度为25 ℃，湿度为40%)。

1.2 药物与试剂 红景天苷：99%纯度，由南京泽朗医药科技有限公司提供，产品编号：ZL20130328。根据《中药药理研究方法学》[4]计算出人与大鼠等效剂量为30 mg/kg，据既往文献，分别给予中、高2种干预剂量。曲美他嗪：98%纯度，由南京泽朗医药科技有限公司提供，产品编号：ZL20130328QB，计算出人与大鼠等效剂量，其抗氧化应激最大剂量为2 mg/kg。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ),购于美国Sigma公司，产品编号: Sigma0130。大鼠内皮素-1(ET-1)试剂盒、大鼠醛固酮试剂盒、大鼠缺氧诱导因子1α(HIF-1α)试剂盒、大鼠Ⅰ型胶原(PⅠP)试剂盒均购于上海蓝基生物科技有限公司。

1.3DCM大鼠模型制备 将40只成年雄性SD大鼠在禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(55 mg/kg)后，予高糖高脂饲料喂养72 h后用罗氏血糖仪(德国罗氏诊断有限公司，ACCU-CHEK活力型)检测大鼠血糖值，空腹血糖值>16.7 mmol/L，则判定糖尿病大鼠模型成功。据文献[5]，对糖尿病大鼠继续予高糖高脂饲料饲养4周，则糖尿病心肌病大鼠成模。

1.4 分组与给药 剔除造模期间死亡及造模失败的大鼠，剩余大鼠36只，对其进行编号，利用随机数字表法随机分为对照组，红景天苷中、高剂量组及曲美他嗪组，每组9只。红景天苷中、高剂量组分别给与50 mg/kg及100 mg/kg红景天苷灌胃，曲美他嗪组给予2 mg/kg曲美他嗪灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃。连续给药12周后，死亡5只，对照组剩余7只，其他各组均剩余8只，对上述大鼠行腹主动脉取血并离心后取血清检测。

1.5 酶联免疫法(ELISA法)检测血清中HIF-1α、ET-1、PⅠP、醛固酮的含量 取出对应试剂盒，于室温(20～25 ℃)放置30 min，取出酶标板，按标准品的分别有序加入50 μL的标准品溶液于空白孔中；
空白微孔中加入50 μL样品，将酶标板用封板密封后，37 ℃孵育1 h(在孵育箱中保持恒温恒湿)，充分洗涤酶标板5次，保持各孔有足够的水压(浓缩洗涤液以1∶100的比例与蒸馏水混匀)，酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干，各孔先后加入显色剂(上海蓝基生物科技有限公司)A50 μL及B 50 μL；
37 ℃避光反应10～15 min，然后各孔加入50 μL终止液，终止反应。选取波长为580 nm的酶标仪(美国Bio Tek,Power Wave XSZ)上读取相应各孔的光密度(OD)值，设置B=标准品OD值，BO=标准品0点的OD值。设置标准品浓度为横坐标，B/BO%为纵坐标，在对数坐标纸上描绘出标准曲线，然后在标准曲线上查找相对应浓度范围(针对不同检测指标的敏感度不同，如HIF-1α敏感度为0.001 pg/mL；
ET-1敏感度为0.001 ng/mL；
PⅠP敏感度为0.001 pg/mL；
醛固酮敏感度为0.001 pg/mL)。

2.1 红景天苷对DCM大鼠血清中HIF-1α及PⅠP的影响及与曲美他嗪组的对比 统计结果显示，对照组血清中HIF-1α及PⅠP含量明显高于红景天苷中、高剂量组及曲美他嗪组，差异有统计学意义(P<0.05)，但红景天苷中、高剂量组及曲美他嗪组的组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 红景天苷对DCM大鼠血清中HIF-1α及PⅠP的影响

2.2 红景天苷对DCM大鼠血清中ET-1及醛固酮的影响及与曲美他嗪的对比 统计结果显示，对照组血清中ET-1及醛固酮水平显著高于红景天苷中、高剂量组(P<0.05)，但与曲美他嗪组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；
且红景天苷高剂量组在降低醛固酮方面明显优于曲美他嗪组(P<0.05)；
曲美他嗪组与红景天苷中、高剂量组的组间比较，在降低血清中ET-1方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 红景天苷对DCM大鼠血清中ET-1及醛固酮的影响

DCM是糖尿病的重要心血管并发症，随着糖尿病(1型及2型)发病率的逐年升高，糖尿病人群中心血管系统疾病发病率为30%～80%[6]。DCM的发病机制复杂，目前认为，钙平衡调节异常、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS系统)激活、氧化应激、炎症反应、自噬、糖脂代谢紊乱等多重因素相互作用，影响心肌的能量代谢和微循环，进而造成心脏功能及结构的改变[7]。针对糖尿病心肌病，目前以经验性控制血糖、预防靶器官损害、抑制RASS系统过度激活以及抗心肌纤维化等治疗为主[8,9]，其治疗原理及循证证据尚不足。

红景天苷是中药红景天的主要有效成分，有研究[10]表明，红景天苷能通过调节血管痉挛及修复血管损伤的方式，产生血管保护作用并改善血管功能。ET-1是ET家族中的主要成员，具有强烈的血管收缩作用，持续升高的ET-1可导致心肌肥厚、心脏异常重构进而导致心血管恶性事件的发生[11]。本研究通过红景天苷干预DCM大鼠，检测血清中ET-1的含量提示红景天苷能明显降低DCM大鼠血清中ET-1的含量，提示红景天苷能通过抑制ET-1的生成产生血管内皮的保护作用，从而达到保护心肌、改善预后的目的。醛固酮处于RASS系统的下游，异常增高的醛固酮加重心脏的前、后负荷，导致心肌肥大、纤维化及坏死，损害心功能。本研究通过与对照组大鼠相比，发现红景天苷能明显降低大鼠血清中醛固酮含量，从而达到抑制心肌纤维化、延缓心肌重构及改善心功能的目的。心肌胶原共有5种，其中以PⅠP、PⅢP为主，PⅠP约占心肌胶原总数的80%以上，以纤维粗、僵硬度大、抗牵拉力强为特征，主要用于维持心室壁的强度。心肌纤维化是指过度的心肌胶原组织纤维沉积，胶原含量及胶原容积分数明显增加，各型胶原比例严重失调和排列紊乱的一种病理生理状态，PⅠP是细胞外基质的主要组成部分，在DCM的发展过程中，发生基质胶原过度沉积，其中以PⅠP为主，造成心肌纤维化，引起心肌舒张功能障碍[12]。本研究通过红景天苷干预DCM大鼠，与对照组相比，提示红景天苷及曲美他嗪能显著降低DCM大鼠血清中PⅠP含量，进而抑制大鼠心肌纤维化。HIF-1α是一种随着细胞内氧浓度的变化而调节基因表达的转录激活因子，在肾脏和心脏组织中的表达水平最高[13]，可通过激活血管内皮生长因子来促进血管生成，使机体的代谢适应于缺氧环境中，通过调控血红素加氧酶-1(HO-1)表达来发挥其心肌保护作用。本研究发现，对照组大鼠血清中HIF-1α含量明显升高，显著高于红景天苷中、高剂量组及曲美他嗪组，故认为红景天苷及曲美他嗪能显著降低DCM大鼠血清中HIF-1α含量，在改善心肌缺氧致损伤方面有一定意义。红景天苷能显著降低DCM大鼠血清中HIF-1α、ET-1、PⅠP、醛固酮的含量，对DCM的治疗及预后意义重大，有待进一步深入研究，为解决临床实际问题提供明确证据。