24-表油菜素内酯对西瓜农药残留降解作用的研究

杨世英,贾斌鑫,康佳乐,魏 涛,刘峰娟,王 成

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐830000；
2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐），新疆农产品质量安全重点实验室，新疆 乌鲁木齐830091；
3.新疆农业科学院科研管理处，新疆 乌鲁木齐830031）

我国是世界西瓜产量最多的国家，有着悠久的种植栽培历史，新疆是我国西瓜主要的种植基地之一。据统计，2019年新疆西瓜的种植面积为4.717万hm2左右，产量达到270.38万t[1]。西瓜生长过程中病虫害种类多、发生频繁，因此需要喷施农药来预防病虫害的发生。在病虫害综合防治中，杀虫剂、杀菌剂等化学农药起到了无可替代的作用[2]，但这些化学物质的大量使用会对生态环境和食品安全造成诸多不利影响。自然界中广泛存在多羟基化的甾醇类物质，Mitchell等[3]第一次从油菜花粉中分离出具有较高活性并且能使菜豆幼苗加速生长的物质，他们将这种物质命名为油菜素（Brassin）。Grove等[4]确定了该物质与甾醇内酯化学结构相同，便将该物质命名为油菜素内酯（Brassinolides，BRs）。由于油菜素内酯对植物的促进作用强，普遍被人们认为是第六大植物激素[5]。目前，油菜素内酯研究在果蔬农药解毒方面取得了重大突破，其中24-表油菜素内酯（EBR）的应用较为常见。Sharma等[6]发现，芥菜经外源EBR喷施后，H2O2和O2含量明显降低，同时超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化物酶（POD）等酶的活性显著增强，并且大幅降低了芥菜幼苗中的农药残留量。殷燕玲等[7-8]研究发现，EBR喷施大蒜、韭菜能明显改善农药对植物体内的各种毒害作用。EBR对农药胁迫有改善作用，可调节渗透调节物质如可溶性蛋白含量，激活植物的抗氧化防御系统[9]，促进农药降解。目前，EBR处理对西瓜采后农药残留的降解和相关机理研究较少。团队前期使用不同浓度的EBR处理西瓜，筛选出最佳处理浓度为0.5 mg/L。本试验通过研究EBR处理对西瓜果实农药残留含量、解毒酶活性、活性氧代谢以及解毒物质的影响，探讨EBR对西瓜果实农药残留降解机理，以期为EBR在西瓜中的应用提供理论参考和技术支持。

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

供试西瓜种子购自昌吉市金丰种植有限责任公司，种植于新疆农科院安宁渠试验田。试验挑选大小均匀、成熟度相同、无损伤、无病害的西瓜果实。

24-表油菜素内酯，北京索莱宝科技有限公司；
乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技中国有限公司；
无水硫酸镁，成都市科隆化学品有限公司；
氯化钠，天津市盛奥化学试剂有限公司；
陶瓷均质子，河北艺心逸科技有限公司；
苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性生化检测试剂盒、过氧化氢含量检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DW-86W100医用低温保存箱（海尔），青岛海尔特种电器有限公司；
Thermo Fisher Scientific ST-16gR高速冷冻离心机，Thermo Electron Led Gmbh（德国）；
Model XSE204分析天平，METTLER TOLEDO（瑞士）；
XEVO-TQ液相色谱串联四极杆液质联用仪，美国Waters公司；
BSA223s型电子天平，美国赛多利斯公司；
UV-2700紫外可见分光光度计，日本岛津公司；
W5L-1水浴恒温器，金坛市宏华仪器厂；
Vortex-DS多用途涡旋混合仪，上海汗诺仪器有限公司；
HH.S21-6电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备。

1.2 方法

1.2.1 田间处理及样品采集

根据本团队前期对西瓜中农药残留风险评估的结果，筛选出在西瓜中农药使用频率高、残留含量较高、风险较大的4种农药为啶虫脒、多菌灵、苯醚甲环唑、腈菌唑。西瓜分别用1、0.5、0.1、0.01 mg/L的EBR处理后，喷施3.3 mL/L啶虫脒、2.5 g/L多菌灵、2.5 g/L苯醚甲环唑、2.5 g/L腈菌唑，测定各处理组西瓜果实中4种农药含量。结果发现，0.5 mg/L EBR降解这4种农药残留的效果最好。因此，本试验选取0.5 mg/L油菜素内酯喷施西瓜。

在西瓜成熟前24 d左右喷施EBR，以清水处理为对照，第2天喷施上述4种农药，然后分别于喷药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、15 d、24 d进行样品采集，2020年6—7月完成样品采集工作。

1.2.2 样品前处理方法

西瓜果实（全果）按照四分法切分，匀浆处理后称取10 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈（色谱纯），涡旋1 min，摇床振荡30 min，取出后向离心管中加入2 g NaCl和2 g无水硫酸镁，再涡旋1 min，以10 000 r/min常温离心3 min，取上清液10 mL加入到N-丙基乙二胺（PSA）管中，充分振荡1 min，再以10 000 r/min常温离心1 min，取上清液过0.22 μm滤膜并加入到进样小瓶中，然后测定农药残留。剩余部分西瓜切成均匀的小块，用锡纸包好后在液氮中浸泡，等待彻底凝固后置于-20℃下保存。

1.2.3 农药残留测定方法

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（ACQUITYUPLCBEH，50mm×2.1mm，1.7 μm，Waters公司）；
柱温：40℃；
样品室温度：10℃；
采用二元梯度洗脱分离，以甲醇（A）和1 mmol/L乙酸铵水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，流速0.2 mL/min，进样体积1 μL，运行15 min。梯度洗脱条件：0.0～1.0 min，5%A；
1.0～2.0 min，5%～30%A；
2～3 min，30%～45%A；
3～7 min，45%～95%A；
7～12 min，95%A；
12～13 min，95%～5%A；
13～15 min，5%A。

1.2.3.2 质谱条件

采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）电喷雾离子源，选择反应监测（SRM）电离源模式为电喷雾离子化（ESI），离子源极性为ESI＋；
离子源温度350℃；
N2流量1.0 L/h；
Ar流量0 mL/min；
毛细血管电压3.00 kV；
脱溶剂温度650℃；
锥孔气流量0 L/h；
六级杆透镜电压0 V。各目标化合物质谱参数见表1。

表1 农药的主要质谱参数Table 1 Main mass spectrum parameters of pesticides

1.2.4 酶活、代谢产物、活性氧代谢测定方法

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性，以及丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量、超氧阴离子（O2）产生速率、还原型谷胱甘肽含量的测定参照曹建康等[10]的方法。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、过氧化氢含量使用索莱宝试剂盒进行测定。

1.2.5 数据处理

使用Origin 2018软件录入数据并作图，应用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用邓肯氏多重差异进行比较，当P＜0.05时，表示差异具有显著性，当P＜0.01时，表示差异具有极显著性。

2.1 EBR处理对西瓜果实中农残含量的影响

由图1A可知，西瓜喷施农药后，EBR处理组除喷药后5 d外，其余时间果实中啶虫脒含量均低于对照组；
喷药后1、7、9 d，EBR处理组果实中啶虫脒含量比对照组分别下降了83.33%、78.26%、74.58%，呈现显著性差异（P＜0.05）。喷药后24 d，EBR处理组相比于对照组下降了51.80%。

由图1B可知，喷药后0、1、5、7 d，EBR处理组西瓜果实中多菌灵含量比对照组分别降低了85.29%、59.32%、40.74%、76.19%，显著低于对照组（P＜0.05）。喷药后3、9、15 d，EBR处理组果实中多菌灵含量与对照组之间差异不显著。喷药后24 d，EBR处理组果实中多菌灵含量比对照组下降了23.68%。

由图1C可知，喷药后0～5 d，EBR处理组果实中苯醚甲环唑含量显著低于对照组（P＜0.05），5 d后，处理组与对照组果实中苯醚甲环唑含量差异不显著。对照组除了喷药后1、3、5 d，其余时间果实中苯醚甲环唑含量均在限量值以下。由此可见，在喷施农药后5 d内喷施EBR组西瓜果实中苯醚甲环唑含量可有效降低。

由图1D可见，喷药后1、3、5、7 d，对照组果实中腈菌唑含量显著高于EBR处理组（P＜0.05），分别为EBR处理组的9.23、1.55、2.46、10.02倍。9 d以后，对照组与EBR处理组果实中腈菌唑含量差异不显著。由此可见，喷施EBR在一定程度上可以降低西瓜果实中腈菌唑的含量。

图1 EBR处理对西瓜果实中4种农残含量的影响Fig.1 Effects of EBR treatments on the contents of four agricultural residues in watermelon fruits

由图2可以看出，在整个采样期间，EBR处理组西瓜果实中农残含量均显著低于对照组（P＜0.05）。EBR处理组与对照组均在喷药后1 d达到最大值，分别为0.52、2.29 mg/kg。喷药后5～24 d，两组样品中农残含量的变化趋势大致相同。喷药后24 d，EBR处理组果实中农残含量比对照组降低了24.44%。结果表明，EBR处理能有效降低西瓜果实中农药残留的含量。

图2 EBR处理对西瓜果实中农残含量的影响Fig.2 Effects of EBR treatments on pesticide residues contents in watermelon fruits

2.2 EBR处理对西瓜果实中活性氧代谢的影响

由图3A可得，采样周期内，EBR处理组果实的超氧阴离子产生速率均低于对照组（1 d和15 d除外）。喷药0 d时，对照组超氧阴离子产生速率是EBR处理组的3.6倍，二者间差异达显著水平（P＜0.05）。1～24 d，EBR处理组与对照组的超氧阴离子产生速率趋于稳定。结果表明，喷施EBR能在一定程度上降低西瓜果实中超氧阴离子的产生速率。

由图3B可得，在西瓜整个成熟期间，处理组果实中过氧化氢含量均高于对照组。喷药后24 d，EBR处理组过氧化氢含量比对照组提高了6.4%。结果表明，EBR处理能够在一定程度上提高西瓜果实中过氧化氢含量的积累。EBR可能将西瓜果实代谢产生的不稳定的超氧阴离子转化为更为稳定的过氧化氢，从而避免了超氧阴离子对细胞的损害。

图3 EBR处理对西瓜果实中活性氧代谢的影响Fig.3 Effects of EBR treatments on hydrogen peroxide metabolism in watermelon fruits

2.3 EBR处理对西瓜果实中解毒酶活性的影响

由图4A所示，对于西瓜果实抗坏血酸过氧化物酶活性，0～5 d，EBR处理组与对照组之间无显著性差异；
7～24 d，EBR处理组迅速升高，显著高于对照组（P＜0.05）；
喷药后24 d时，EBR处理组比对照组提高了435.58%，二者间呈显著性差异（P＜0.05）。

由图4B所示，EBR处理组西瓜果实的过氧化氢酶活性在整个采样期间均显著高于对照组果实（P＜0.05）。喷药后24 d时，EBR处理组西瓜果实的过氧化氢酶活性达到最大值，是对照组果实酶活性的3.4倍，二者间呈显著性差异（P＜0.05）。

由图4C所示，在整个采样期间EBR处理组西瓜果实的谷胱甘肽还原酶活性一直高于对照组，在喷药后3、5、7、9、15 d采样时，样品的酶活性变化不明显；
但在0、1、24 d采样时，EBR处理组西瓜果实的GR活性分别是对照组的2.94、1.83、2.44倍，显著高于对照组（P＜0.05）。

图4 EBR处理对西瓜果实中解毒酶活性的影响Fig.4 Effects of EBR treatments on detoxification enzymes activities in watermelon fruits

由图4D所示，西瓜喷施农药后的整个采样期间EBR处理组果实中苯丙氨酸解氨酶活性始终显著高于对照组（P＜0.05），且处理组与对照组的变化趋势相同。喷药后0 d采样时，EBR处理组果实中PAL活性是对照组的6.68倍。5 d采样时，对照组果实的PAL活性比EBR处理组果实中酶低48.26%。24 d采样时，EBR处理组PAL活性是对照组的5.35倍。

由图4E所示，EBR处理组西瓜果实超氧化物歧化酶活性在整个采样时期极显著高于对照组（P＜0.01）。EBR处理组喷药后1 d果实超氧化物歧化酶活性显著提升，是对照组的1.79倍。1～5 d，EBR处理组果实的超氧化物歧化酶活性缓慢下降。5～24 d果实超氧化物歧化酶活性稳定在1.3ΔOD560/（min·g），而对照组果实超氧化物歧化酶活性自始至终稳定在0.8ΔOD560/（min·g）。

由图4F所示，在整个采样期间，EBR处理组果实过氧化物酶活性始终高于对照组。EBR处理组果实的过氧化物酶活性呈现先升高后降低的趋势，且在喷药后5 d达到最大值，显著高于对照组（P＜0.05）。喷药后24 d时，EBR处理组西瓜果实中过氧化物酶活性较对照提高了12.91%，显著高于对照组（P＜0.05）。

2.4 EBR处理对西瓜果实生理代谢的影响

还原型谷胱甘肽可与自由基等毒性物质结合形成机体更易代谢的物质，从而减少自由基的含量[11]。由图5A可知，在整个采样期间，喷施农药后的EBR处理组西瓜果实中还原型谷胱甘肽含量与对照组相比显著提高（P＜0.05）。喷药后0～5 d的EBR处理组果实还原型谷胱甘肽含量迅速上升，且5d时的GSH含量为对照组的1.75倍，二者间呈显著性差异（P＜0.05）。5～7 d，EBR处理组与对照组果实的还原型谷胱甘肽含量均急剧下降，7～9 d两组又迅速上升。喷药后24 d，EBR处理组GSH含量相比于对照组上升了17.5%，二者间差异显著（P＜0.05）。

图5 EBR处理对西瓜果实生理代谢的影响Fig.5 Effects of EBR treatments on physiological metabolism in watermelon fruits

丙二醛（MDA）的产生标志着细胞膜结构的损伤，其含量多少直接表明了膜损伤的程度，且MDA对细胞的损伤性能引起部分酶失活[12]。由图5B可以看出，喷施农药后整个采样期间，对照组西瓜果实中MDA含量始终显著高于EBR处理组（P＜0.05）。在整个采样期间，EBR处理组MDA含量一直稳定在0.8 μmol/g附近；
而对照组果实中MDA含量在0～1 d迅速上升并达到最大值（1.44 μmol/g），显著高于EBR处理组（P＜0.05）；
1～24 d的对照组果实中MDA含量稳定保持在1.3 μmol/g附近。

可溶性蛋白是众多植物体内酶的重要组成成分[13]。由图5C可见，EBR处理组西瓜果实中可溶性蛋白质含量与对照组的变化趋势相同。喷施农药后的0～3 d，EBR处理组与对照组相比，其可溶性蛋白质含量分别提高了45.45%、56.58%、16.64%，均显著高于对照组（P＜0.05）；
喷药后的5～24 d，EBR处理组的可溶性蛋白质含量与对照组之间差异不大。

喷施EBR可以维持植物在逆境环境下体内的代谢平衡，通过提高可溶性蛋白等渗透调节物质的产生，进而提高过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等部分解毒酶的活性，从而迅速清除细胞内多余的活性氧及自由基，使其达到平衡状态，并一定程度上减少植物细胞膜与外界的流动性[14]。外源喷施EBR可以显著提高半夏块茎中可溶性蛋白含量和PAL活性[15]。叶片喷施不同浓度的EBR可使可溶性蛋白质和脯氨酸含量显著升高，对稳定细胞膜的结构具有积极作用[16]。番茄通过EBR处理，能使果实中可溶性蛋白含量显著增加[17]。EBR处理有效抑制了辣椒果实中MDA含量的积累，减缓了总解毒能力的下降，较好地保持辣椒果实中解毒酶的活性，防止活性氧的过量积累对辣椒机体造成损害，保护细胞膜的完整性和功能性[18]。外源2,4-表油菜素内酯预处理能够降低黄瓜叶片中H2O2和O2的积累，维持植物体内氧化还原平衡[19]。番茄提前喷施EBR，能使其在逆境环境中更加迅速地激活抗氧化酶系统来清除细胞所产生的H2O2和O2[20]。研究发现H2O2在活性氧代谢中对机体的毒害作用最小，可以以一种重要的信号分子来调节植物的生长发育过程[21]。EBR可显著加速农药残留的降解，其机制可能与激发植物内在解毒机制有关。在实验室相对封闭的环境下，油菜素内酯处理能显著促进番茄、黄瓜、辣椒等作物中啶酰菌胺、毒死蜱、百菌清等农药残留的降解[22-24]。Zhou等[25]指出0.1 mmol·L-1EBR处理可使水稻、茶叶、西兰花、草莓等植物上常见的有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类农药残留量减少30%～70%；
EBR能上调解毒关键酶的活性和解毒相关基因，并加快谷胱甘肽的更新，从而达到加速植物体内农药残留的降解代谢，进而降低植物体内农药残留量。同时，EBR能激活解毒系统，减少农药引起的活性氧累积。植物通过体内存在的不同解毒酶和解毒物质来清除过氧化物质以维持体内平衡，GSH是农药降解代谢中重要的中间物质，它能与农药结合后将有毒化合物转化为活性较低、水溶性较强的物质，从而参与农药在植物细胞中的解毒过程[26]。外源EBR处理苜蓿幼苗后，其体内的解毒酶SOD、GPX、APX和GR等酶的活性显著上升[27]。

试验结果表明，EBR处理可保持西瓜果实中H2O2、可溶性蛋白、GSH含量，使果实中解毒酶（POD、SOD、CAT、GR、PAL、APX）活性维持在较高水平，显著抑制O2的生成速率和MDA的积累，从而有效加速西瓜果实中啶虫脒、多菌灵、苯醚甲环唑、腈菌唑的降解速率。BR处理对西瓜果实中不同农药残留的降解效果有一定的差别，但EBR总体上对西瓜果实农残降解效果作用显著，这说明EBR在农药降解上具有灵活性。因此，为了提高西瓜的食用安全性，可以向其喷施适宜剂量的EBR，使得农药残留量大幅降低。