胃癌中新颖hsa_circ_0003071的特征、功能及预后分析

黄伟，周新科，林铭珍，肖瑶，梁敏，姚文霞

(广州医科大学附属第五医院肿瘤科,广州市加速康复腹部外科重点实验室，广东 广州 510700)

随着测序技术和生物信息学的飞速发展，研究人员已发现越来越多的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。作为ncRNA家族成员，环状RNA(circular RNAs,circRNAs)在人类疾病中扮演着非常重要的角色。其中，环状RNA是一类具有组织和细胞特异性表达模式的ncRNA的成员[1]。在结构方面，circRNA是共价环状的RNA，起源于前体信使RNA并通过反向剪接产生的,没有5"帽结构和3"多聚腺苷酸尾结构[1]。在哺乳动物细胞中，环状RNA至少可以分为两种类型，包括外显子衍生的环状RNA和套索内含子衍生的环状RNA[2]。此外，环状RNA由于其特殊的结构对RNase R消化有抵抗力[3]。一般来说，环状RNA在组织细胞中的表达量是很少的[4]，但是有些环状RNA却比它们相应的线性RNA表达更丰富[5]，这提示环状RNA在该组织细胞中具有某些特殊功能。通过大量研究发现环状RNA广泛存在于人体健康组织与病理组织中，比如大脑[6]、胸腺[7]、宫颈癌[8]、结核[9]等。研究人员利用越来越多的证据阐述了circRNA在生物学和病理过程中具有多种功能[10]，例如通过充当微小RNA(microRNA,miRNA)海绵[11]、干扰剪接[12]、产生多肽或者蛋白质[13]等，调控多种生命活动(如细胞自噬[14]、基因转录[15]、上皮间充质转化调节[5]、药物抵抗性[16]等)

精子发生相关丝氨酸丰富2样(spermatogenesis associated serine rich 2 like，SPATS2L)基因，又名应激颗粒和核仁蛋白(stress granule and nucleolar protein，SGNP)[17]。它位于2号染色体2q33.1,包含176.38kb碱基对。Danielle等研究表明SPATS2L是一个可能具有至少30个剪接变体的复杂基因座[18]，并且它是一个在许多组织中高表达的基因，比如胸腺、肺组织等[19]。目前，尽管关于基因SPATS2L在生理学和病理学过程中的机制研究较少，但是有研究表明它在某些生理学过程和疾病的发生发展中发挥着关键的作用。近些年，多个研究团队通过全基因组关联研究(Genome wide association study，GWAS)成功地鉴定了多种疾病的遗传风险基因座，其中多项研究发现基因SPATS2L与多种疾病发生发展及预后相关。例如，Himes等通过GWAS确定了在哮喘患者中SPATS2L为一种新的支气管扩张反应基因，并且进一步实验证明敲除SPATS2L将导致β2肾上腺素能受体水平升高[19]。Wang等利用GWAS证实了尘肺病的遗传易感位点中存在多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs),其中一个SNP鉴定为SPATS2L中的rs985256[20]。此外，Wang等也通过GWAS发现SPATS2L中存在多个SNPs，并进一步表明SPATS2L可能通过调节β2-肾上腺素能受体的蛋白表达间接影响空腹血糖水平，从而增加葡萄糖的吸收。另外，Wang等研究团队指出SPATS2L的高表达与EGFR扩增和CDKN2A缺失的胶质瘤的预后呈负相关[21]。近来许多研究指出，基因SPATS2L在人体多个系统中起着非常重要的作用。比如，Zhu等在骨骼肌细胞的基因诱捕实验中，发现基因SPATS2L参与了核糖体的生物发生和翻译控制，进一步研究阐明在氧化应激和外源化合物亚砷酸钠刺激时基因SPATS2L可能参与5.8S核糖体RNA的加工或输出[17]。Smeland等表明精神分裂症与海马体积之间共享一个靠近基因SPATS2L的基因座rs1653290[22]。Fuentes等表明在一项韩国研究队列中，SPATS2L中的SNPs与收缩压和舒张压有关。此外，SPATS2L还参与淋巴细胞的活化[23]、蛋白复合物生物发生[17]等生理过程，以及通过调控脑源性神经营养因子影响慢性腹痛患者睡眠质量等病理过程[24]。

经过高通量测序技术的高速发展，研究员在人类各种疾病中发现了大量新颖环状RNA，特别是在癌症中。目前，随着环状RNA在肿瘤研究的深入，于肿瘤中探索新颖的环状RNA已迫在眉睫。因此，我们根据circBase[25-28]收录信息，发现人类基因SPATS2L可通过反向剪接产生12个环状RNA，我们从样本分布较为广泛，同时评分较高的环状RNA中重点关注到hsa_circ_0003071，从其表达量、反向剪接位点的验证、是否耐受RNase R、亚细胞定位、蛋白质翻译潜能五方面探究其基本特征，利用生信预测该环状RNA的miRNA结合位点以及miRNA的靶基因，构建circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络，对上述靶基因合集进行基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，并利用STRING在线工具绘制下游靶基因集的蛋白质互作网络图，并利用Cytoscape3.8.2软件中的插件“MCODE”鉴定出关键基因，最后做关键基因在胃癌中的生存分析。本研究我们首次关注到一种新颖的环状RNA hsa_circ_0003071在胃癌中的表达量、结构特征、功能及预后，这为后续深入研究环状RNA在胃癌的发生发展中的具体机制以及治疗胃癌提供一种新的思路。

1.1 实验材料

TRIzol试剂、引物购自Invitrogen公司、反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Code NO:RR047A)、实时定量PCR试剂盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Code NO:RR820A)、RNase-free H20均购自TaKaRa公司，组织RNA提取试剂盒plus(RN002plus)购自奕衫生物公司，DNA maker(Cat.M10-02)购自OMEGA公司，DNA loading buffer购自Takara公司，PARIS Kit(AM1921)购自生命技术公司，RNase R(Epicentre,RNR07250)购自ILLUMINA公司，RNase R纯化试剂盒RNeasy MinElute Cleanup Kit 购自 Qiagen 公司。5对新鲜冰冻胃癌与癌旁组织取自于广州医科大学附属第五医院，在获得手术切除的组织之前，患者已签署了知情同意书。此实验获得了广州医科大学附属第五医院医学伦理委员会的批准。

1.2 hsa_circ_0003071表达量验证和反向剪接位点的PCR扩增验证及测序验证

根据在circBase数据库(http:∥www.circbase.org/)中检索得到的hsa_circ_0003071序列，设计一对引物来扩增出包含反向剪接位点的序列，引物序列为：Forward Primer 5’-CTTCGTGGGGTCACAGAACAAT-3’；
Reverse Primer 5’-TCCTTCTCGCAGCCATTCATG-3’；
Β-ACTIN,Forward Primer 5’-TCGGTTGGAGCGAGCATC-3’；
Reverse Primer 5’-TGTGGACTTGGGAGAGGACTG-3’。

利用APPLIED BIOSYSTEMS 7500 REAL TIME PCR 平台检测胃癌中PCR扩增的产物hsa_circ_0003071。PCR 扩增的模板为细胞的cDNA,扩增产物的长度为159 bp。PCR 产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送广州艾基生物技术有限公司进行第一代测序。

1.3 核糖核酸酶R(Ribonudease R,RNase R)处理

1.3.1RNA提取 收集细胞，用Trizol法提出细胞的总RNA。

1.3.2RNase R消化 实验分为RNase R组和对照组，各10 μg RNA，分别加入20 U(2U/μg)的RNase R和等量的ddH2O，37 ℃孵育10 min。

1.3.3RNA纯化 使用RNeasy MinElute Cleanup Kit试剂盒纯化经RNase R消化得到的RNA,随后分别测定2组 RNA 浓度。

1.3.4逆转录及实时定量 PCR 用 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒将纯化后的 RNA 逆转录成 cDNA,然后通过 TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ 试剂盒进行 PCR 扩增，反应体系如下：TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μl, ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl,正反向引物各0.8 μl，ddH2O 6 μl,cDNA 2 μl,一共20 μl。

1.4 hsa_circ_0003071 的细胞质和细胞核表达量分析

1.4.1细胞质、细胞核 RNA 分离及提取 收集细胞，用试剂盒(PARISTM Kit AM1921)将细胞质、细胞核中的 RNA 分离并提取出来，随后进行细胞质和细胞核 RNA 浓度的测定。

1.4.2逆转录及定量 PCR 分别取细胞质和细胞核 RNA 各500 ng,将其逆转录成cDNA,此过程所用试剂盒同“1.3.4”。随后以该 cDNA 为模板进行实时定量 PCR,反应体系和反应条件同“1.3.4”。

1.5 hsa_circ_0003071 翻译蛋白的潜能分析

通过 circRNADb(http:∥reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)数据库数据来确定 hsa_circ_0003071 翻译蛋白的潜能，并根据收录数据绘制该环状 RNA 翻译蛋白的示意图。

1.6 miRNA结合位点的预测

分别利用circInteractome(http:∥circinteractome.nia.nih.gov/)和circBank(www.circbank.cn)2个在线数据库来预测环状RNA上 miRNA 的结合位点，并取2个数据库预测结果的交集作为环状 RNA 可能靶向结合的 miRNA:hsa-miR-604和hsa-miR-1205。

1.7 miRNA靶基因的预测

选取 miWalk 数据库的12种算法中9种或10种算法预测得到的靶基因作为 hsa-miR-604 和 hsa-miR-1205 的潜在靶基因。

1.8 circRNA-miRNA-mRNA 网络的构建

通过选取 miWalk 数据库中9种算法预测hsa-miR-604和 hsa-miR-1205的靶基因以及10中算法预测 hsa-miR-604和 hsa-miR-1205的所有靶基因，根据竞争性内源性RNA(competing endogenous,ceRNA)理论，利用 Cytoscape3.8.0 软件构建circRNA-miRNA-mRNA网络，并将其可视化。网络图的节点代表不同的 RNA 分子，连线代表节点之间的相互作用。

1.9 靶基因集合的功能及通路分析

利用DAVID(http:∥david.ncifcrf.gov/)数据库中“Function AnnotationChart”功能模板分别对预测的 miRNA靶基因集合进行GO生物过程和分子功能分析，并利用KEGG分析功能进行信号通路分析。

1.10 靶基因集合的蛋白质互作图及筛选关键基因

利用STRING 11.0(https:∥www.string-db.org/)中7种活性互作来源，分别为 “Textmining”、“Experiments”、“Databases”、“Coexpression”、“Neighborhood”、“Gene Fusion”、“Cooccurrence” 以及设定最小互作关系分数为0.4，对hsa_circ_0003071预测的下游靶基因集合绘制蛋白质互作图，利用Cytoscape3.8.2 软件进行可视化。随后，利用Cytoscape3.8.2 软件中的插件“MCODE”筛选关键基因。

1.11 关键基因在胃癌中的生存分析

利用UALCAN(http:∥ualcan.path.uab.edu/)数据库hsa_circ_0003071预测的下游关键基因在胃癌中的生存预后分析。

2.1 hsa_circ_0003071在胃癌及癌旁组织的表达量

为了鉴定环状RNA在胃癌及癌旁组织的相对表达量，我们通过Q-PCR技术扩增hsa_circ_0003071，结果显示hsa_circ_0003071在胃癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(图1)。

图1 hsa_circ_0003071在胃癌和癌旁组织的表达量

2.2 hsa_circ_0003071 的PCR扩增及一代测序鉴定

为了鉴定我们研究的环状RNA的剪接位点，我们通过PCR扩增hsa_circ_0003071，琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示成功扩增出包含hsa_circ_0003071反向剪接位点的大小为159 bp的片段(图2A)。序列分析表明，hsa_circ_0003071来源于基因 SPATS2L 的转录本NM_001100422,含有一个外显子，外显子3’端反向剪接于5’端。此外，测序结果进一步证实这一结论，箭头左端为基因 SPATS2L 外显子末端序列，右端为外显子的起始序列(图2B)。

A.PCR扩增鉴定; B.测序峰图

2.3 hsa_circ_0003071 的 RNase R 抵抗性及亚细胞内表达定位分析

CircRNAs 稳定闭环结构的存在使 RNase R 不能将其识别降解，因此比线性RNA更稳定，能耐受RNaseR消化。hsa_circ_0003071、CDRas 的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而 GAPDH 基因的线性 mRNA 表达则明显降低(P<0.05)，表明 hsa_circ_0003071、CDR1as耐受RNase R的消化(图2A)。分离细胞的胞核、胞质 RNA 后，用 qPCR 分别检测胞核与胞质中 hsa_circ_0003071、UI snRNA(U1)、GAPDH 和CDRlas的相对分布量。已知 U1 RNA 主要定位于胞核，GAPDH RNA主要定位于胞质，以 U1 和 GAPDH 分别作为胞核和胞质定位的参照。U1 和 GAPDH 分别主要位于细胞核和细胞质，提示本实验胞核、胞质 RNA 分离成功；
hsa_circ_0003071 在细胞质中的表达量显著高于细胞核(胞质与胞核 RNA 含量比值约为8)，表明hsa_circ_0003071主要位于细胞质;与 hsa_circ_0003071 类似，阳性对照环状 RNA CDR1as 也主要分布于细胞质，与之前的报道相符[10](图3B)。

A.环状RNA的相对表达量;B.环状RNA在细胞质、细胞核中的表达;与对照组比较，P<0.01

2.4 hsa_circ_0003071翻译蛋白的潜能分析

环状RNA可以不依赖于5’端帽子结构而依赖内部核糖体进入位点(Intemal Ribosome Entry Site，IRES)的顺式调控元件来启动蛋白翻译。Hsa_circ_0003071含有一段符合IRES特征的元件，其起始-终止位点分别为73-109，R评分为1.401292。并且hsa_circ_0003071存在一个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码一条含124个氨基酸的蛋白质，起始密码子始于第128位核苷酸，终止密码子位于环绕两周后的第8位核苷酸(2r+8)，见图4。

图4 hsa_circ_0003071的蛋白翻译示意图

2.5 hsa_circ_0003071上miRNA结合位点的鉴定

miRNA主要在细胞质中发挥调控基因表达等作用，根据hsa_circ_0003071主要分布于细胞质的特性，我们分别通过CircInteractome和circBank数据库对hsa_circ_0003071作为miRNA海绵的潜在能力进行探究。CircInteractome数据库显示环状RNA hsa_circ_0003071上miRNA结合位点数量为7个，包含7种miRNA(图5A)。CircBank数据库显示环状RNA hsa_circ_0003071上miRNA结合位点数量为46个，包含21种miRNA(图5B)。取两个数据库交集的两个miRNA(hsa-miR-604、hsa-miR-1205)作为hsa_circ_0003071最可能结合的miRNA进行下一步靶基因功能探究。

图5 hsa_circ_0003071的结构及其miRNA应答元件示意图

2.6 miRNA靶基因的预测以及 circRNA-miRNA-mRNA 网络可视化图的构建

环状 RNA 通过与 miRNA 相互作用后，可调控下游靶基因的表达。通过 miWalk 数据库预测上述两个miRNA(has-miR-604、has-miR-1205)可能调控的下游靶基因，我们筛选出至少9种算法中存在的靶基因，其数量分别为21个、129个，去除重复基因后共有 148 个下游靶基因。我们从中随机选择21个、30个靶基因构建调控网络图。利用 Cytoscape3.8.0软件，构建了以hsa_circ_0003071、hsa-miR-604 和 hsa-miR-1205以及51个mRNAs为节点(nodes)的circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络图，可显示它们之间的相互作用(图6)。

图6 hsa_circ_0003071的ceRNA网络图

2.7 靶基因合集的GO功能富集及KEGG通路分析

我们利用上述148个靶基因进行GO功能和KEGG通路注释，结果显示：上述靶基因合集分别在12个生物学过程条目和2个分子功能条目中显著富集。其中最显著富集的GO生物学过程条目包括骨骼肌细胞分化、神经元凋亡过程的调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录(图7A)，最显著富集的分子功能条目包括磷酸酶结合、转录激活因子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端序列特异性结合(图7B)。KEGG通路分析结果显示，上述靶基因合集在mRNA监测通路、Hippo信号通路显著富集(图7C)。

A:生物过程GO富集分析；
B:分子功能GO富集分析；
C:KEGG通路分析

2.8 靶基因合集的蛋白质互作图及关键靶基因的鉴定

我们利用上述148个基因通过STRING11.0绘制蛋白质互作图，并去除未与网络连接的基因109个，最终获得39个基因利用Ctoscape3.8.0进行可视化(图8A)。随后，利用插件“MCODE”筛选出关键基因互作模块，我们选取了得分3.0的模块，关键基因分别为CHRNA4,GRM4,GRIK3，参数设置均为默认值(图8B)。

注：A.蛋白质互作图;B.关键基因

2.9 关键基因在胃癌中的生存预后分析

我们利用UALCAN(http:∥ualcan.path.uab.edu/)数据库绘制了关键基因CHRNA4,GRM4,GRIK3在胃癌中的生存预后分析。结果表明，虽然CHRNA4在胃癌预后中无统计学意义(P>0.05)，但依然能看出低表达组相比于高表达组有更高的生存趋势(图9A)，而GRM4和GRIK3在胃癌预后中低表达组相比于高表达组具有更高的生存率(P<0.05)(图9B,C)。

注：A：CHRNA4；
B：GRM4；
C：GRIK3

本研究首先分别从五个方面成功分析了胃癌中新型环状RNA hsa_circ_0003071的特征:胃癌中hsa_circ_0003071表达量显著高于癌旁组织；
hsa_circ_0003071正确成环，是由基因SPATS2L转录本2(NM_001100422)第6号外显子反向剪接形成；
hsa_circ_0003071能够抵抗RNaseR的消化；
hsa_circ_0003071主要分布在细胞质中；
hsa_circ_0003071可能编码含124个氨基酸的蛋白质。随后，我们通过生信方法成功鉴定了hsa_circ_0003071上miRNA的结合位点以及构建了circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络图。GO功能富集分析表明，miRNA的靶基因合集在骨骼肌细胞分化、神经元凋亡过程的调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录等的正向调节和负向调节的生物过程显著富集。KEGG通路分析显示，上述靶基因合集在mRNA监测通路和Hippo信号通路显著富集。最后，我们绘制了上述靶基因合集的蛋白质互作图以及鉴定出胃癌相关的3个关键基因，CHRNA4,GRM4,GRIK3。我们利用这3个关键基因在胃癌中做预后分析，从而为后续深入研究hsa_circ_0003071在其他疾病中的生物学功能提供了新的视角。

根据目前circBase数据库的收录信息，人类基因SPATS2L可经反向剪接产生12个环状RNA，分别是hsa_circ_0057698、hsa_circ_0002354、hsa_circ_0118597、hsa_circ_0057699、hsa_circ_0057700、hsa_circ_0118598、hsa_circ_0057701、hsa_circ_0057702、hsa_circ_0118599、hsa_circ_0003994、hsa_circ_0003071、hsa_circ_0057703，其中hsa_circ_0003071样本分布最广泛，被高通量测序检测到的相关研究最多[25-28]，表明该环状RNA功能相对重要，因此我们重点关注到了hsa_circ_0003071。通过比较hsa_circ_0003071序列与基因组序列，我们发现该环状RNA由基因SPATS2L转录本NM_001100422的第6号外显子经反向剪接而成，剪接点前后的序列分别是AG和GT,符合环状RNA产生的剪接规律[29]。通过PCR扩增、一代测序对hsa_circ_0003071反向剪接位点进行验证，并结合RNase R抵抗性实验，证实了hsa_circ_0003071能正确成环。同大多数circRNA主要位于细胞质一样[27]，hsa_circ_0003071也主要分布于细胞质中，为其充当位于胞质的miRNA 海绵提供了更大可能。以前的研究普遍认为环状RNA不能翻译蛋白，但是近年来，已发现许多环状RNA可以翻译蛋白，比如，circ-ZNF609在肌细胞生成中可以翻译[30]。因此，我们利用circRNADb数据库预测hsa_circ_0003071翻译蛋白的潜能，结果提示该环状RNA可能翻译含124个氨基酸的蛋白质，为后续研究hsa_circ_0003071翻译蛋白功能提供了可能性。

基因SPATS2L编码一种含有558个氨基酸的应激颗粒和核仁蛋白，这种蛋白既位于细胞质中(作为60S核糖体亚基的一个组成部分)，也位于核仁中。SGNP蛋白(NP_001093892.1)包含核糖体L4模体、DUF1387结构域、Ebp2结构域、核输出信号和螺旋结构域。保守的DUF1387结构域，含有300个氨基酸，存在于许多功能未知的假想蛋白(hypothetical protein)之中，并且这些蛋白似乎仅限于哺乳动物。进一步研究表明DUF1387结构域对于引导SGNP进入应激颗粒(Stress Granule,SG)是必要和充分的，但是在外源化合物亚砷酸钠刺激后，它自身就失去了引起SGNP离开细胞核的信号[17]。Ebp2结构域包含200个氨基酸，并且主要与DUF1387结构域片段重叠。Ebp2家族由几个真核rRNA加工蛋白组成，这些蛋白是25SrRNA(酵母)和60S(哺乳动物)亚单位装配成熟所必需的[31]，Ebp2结构域在SGNP的存在表明SGNP可能参与了rRNA加工[17]。来源于基因SPATS2L的has_circ_0003071具有一个IRES和一个ORF，可能具有翻译蛋白的特性，将hsa_circ_0003071的潜在蛋白序列比对到SPATS2L蛋白序列，分析发现该潜在蛋白序列对应SPATS2L蛋白质中的氨基酸66-149。该部分序列包括部分DUF1387结构域，提示hsa_circ_0003071翻译的蛋白可能具有DUF1387结构域的功能。但对于hsa_circ_0003071的蛋白翻译能力及翻译的潜在蛋白的功能还需要进一步深入研究。

环状RNA的功能与其在细胞内亚定位有关，位于细胞质中的环状RNA可以与miRNA相结合并通过行使miRNA海绵作用来发挥功能[32-34]。本研究中hsa_circ_0003071主要分布于细胞质，因此可能具有miRNA海绵的作用。生信表明hsa_circ_0003071具有多个miRNA结合位点，可能通过行使hsa-miR-604或hsa-miR-1205的分子海绵作用影响其下游靶基因的表达，为hsa_circ_0003071作为ceRNA 发挥功能提供了依据。

目前，关于hsa_circ_0003071在人类疾病和肿瘤的相关研究还未报道。不过环状RNA在人类疾病发生发展以及肿瘤发生发展机制的研究领域非常火热。例如：Zhang,Ji-Ru等研究指出环状RNA可能在糖尿病性神经性疼痛的发病机理中也起着重要作用。在患有糖尿病性神经性疼痛的患者以及在糖尿病大鼠的背根神经节中，环状RNA HIPK3在血清中高表达。重要的是，HIPK3的过表达与糖尿病患者神经性疼痛的严重程度呈正相关，并且HIPK3的基因敲除可通过抑制神经炎症来有效缓解糖尿病大鼠的神经性疼痛[35]。Liquan Chen等研究表明，hsa_circ_0084927通过激活hsa-miR-142-3p和上调ARL2促进宫颈癌的发展。体外和体内试验表明，敲除hsa_circ_0084927可阻止细胞的增殖，周期，迁移和侵袭以及肿瘤的形成和生长。另外，一些circRNA甚至被翻译成蛋白质，以履行关键的生物学功能，而一些circRNA被包裹在外泌体中以促进肿瘤转移[36]。生信工具预测显示hsa_circ_0003071具有多个miRNAs结合位点，取数据库交集的两个miRNAs(has-miR-604、has-miR-1205)预测其下游靶基因共148个。本研究中，GO功能注释表明miRNA靶基因合集参与骨骼肌细胞分化、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、RNA聚合酶II启动子转录的负调控、神经元分化等生物学过程。KEGG通路分析表明，hsa-miR-604和hsa-miR-1205 的靶基因合集参与mRNA监测通路。已有研究表明mRNA监测通路与蛋白翻译提前终止相关[37]。对此，我们推测hsa_circ_0003071可能通过竞争结合hsa-miR-604或hsa-miR-1205进而调控下游靶基因翻译蛋白的含量，进而影响细胞的生物学功能，这种调控机制可能为治疗各种疾病和肿瘤提供一个新的思路。当然，这些结论的证实还需要进一步的研究。

GRM4是谷氨酸促代谢性受体家族成员之一，属于G蛋白偶联受体。GRM与谷氨酸的偶联传递信号至第二信使及下游通路，导致缓慢的生理反应。以前的研究揭示了GRM家族在调节离子通道、神经元兴奋性以及神经递质释放中发挥着重要功能[38]。目前，研究者重点关注GRM4在人类恶性肿瘤中的生物学功能。先前的研究表明，GRM4在结肠癌[39]、前列腺癌[40]、多发性骨髓瘤[41]、和其他肿瘤[42]中高表达，并且与肿瘤患者预后相关。同时研究证明GRM4能抑制多种肿瘤的增殖，比如Xiao等表明GRM4通过调节miR-328-3P和miR-370-3P抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭[43]。Zhang等揭示GRM4通过与CBX4互作抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[44]。Luisa Iacovelli等证明GRM4也能抑制成神经细胞瘤的增殖[45]。

GRIK3，谷氨酸离子型红藻氨酸受体家族之一，主要富集在神经组织活化配体受体互作通路中。Gong等研究表明，GRIK3在胃癌组织中高表达，与淋巴结转移和TNM分期相关，另外，高表达的GRIK3在胃癌中充当一个独立性的预后因子[46]。

尽管，我们首次在胃癌中发现了一种新颖的环状RNA hsa_circ_0003071,但是，该环状RNA在胃癌发生发展中发挥何种作用，还未可知。目前，我们大部分的工作偏向于生物信息学的层面，在实际验证方面的工作相对薄弱。

随着我们对circRNA知识的深入学习，许多研究人员已经认识到circRNA不仅充当miRNA海绵，而且某些circRNA可以使反式作用元件海绵化，从而促进或阻断亲本基因的转录。尽管越来越多的环状RNA被发现，其生物学功能也被逐渐认识。然而，大量的环状RNA的功能研究还是空白，因此是否可以从功能性环状RNA的角度进行研究，探索环状RNA在疾病发生发展中的新的通路与机制。在本研究中，我们通过预测模型，预测了hsa_circ_0003071的miRNA为hsa-miR-604或hsa-miR-1205以及下游关键基因GRM4和GRIK3。未来的研究，我们将通过经典的ceRNA机制验证hsa_circ_0003071，hsa-miR-604/hsa-miR-1205，GRM4/GRIK3对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭等功能试验，以及探索该通路是否参与胃癌对放化疗的敏感性等。