2株犬源沙门菌的分离鉴定及耐药性分析

李瑞波，张红波

（1.泰安市理德动物医院有限公司，山东 泰安 271000；
2.山东省威海生态环境监测中心，山东 威海）

沙门菌属于革兰氏阴性菌，呈细长杆菌，多单个存在，偶见两个或多个连在一起，不形成芽孢、无荚膜[1]。随着国民经济的发展，宠物的饲养数量不断攀升，在一定程度上提高了沙门菌由宠物-人类的传播风险[2-3]。在宠物临床中，抗生素的不合理使用甚至滥用，造成耐药沙门菌的产生，且日趋严重[4]。超广谱β内酰胺酶是由细菌质粒介导的一类酶，可导致细菌对头孢菌素类、单酰胺类及青霉素类抗生素耐药[5]。

近年来我国科研工作者对细菌耐药性及传播机制进行了大量的研究，主要集中在食源性沙门菌[6]。关于宠物源沙门菌的资料较少。因此，本研究旨在了解泰安市宠物源沙门菌的分离情况、耐药表型与ESBLs等耐药基因的携带情况，以期为临床宠物沙门菌病用药提供科学依据，同时为人感染宠物源耐药沙门菌提供预警。

1.1 材料

1.1.1 样本来源 在2020年10月到2021年3月在泰安市某3家宠物医院随机采样，共采集犬猫肛拭子84份，包括犬58份（69.05 %），腹泻犬为23份（39.66 %），非腹泻犬为35份（60.34 %）。猫26份（30.95 %），包括腹泻猫15份（57.69 %），非腹泻猫为11份（42.31 %）。

1.1.2 标准菌株 肠炎沙门菌标准菌株（CVCC 3377）、大肠杆菌标准质控菌株（ATCC25922）均购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 培养基 缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、半固体营养琼脂（青岛高科园海博生物技术有限公司），LB固体培养基、LB液体培养基（OXOID,England）。

1.1.4 试剂及试剂盒 ESBLs测定盒（杭州市滨和微生物试剂有限公司）、细菌基因组DNA提取试剂盒（北京市天根生化科技有限公司）、沙门菌血清型测定盒（天润生物药业有限公司）、琼脂糖凝胶（agarose）、TAE缓冲液（北京康为世纪科技有限公司）、2×Taq Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）、核酸染料DuRed（北京泛博生物化学有限公司），试验所需的去离子水与蒸馏水均由实验室制备。

1.1.5 药物 复方新诺明、四环素、多粘菌素B、氟苯尼考、庆大霉素、红霉素、美罗培南、氨苄西林、恩诺沙星、头孢曲松、阿莫西林、多西环素、头孢氨苄、头孢吡肟药敏纸片（杭州滨和微生物试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 沙门菌的分离与培养 将采集的肛拭子置于装有4.5 ml的BPW的无菌摇管中，编号，之后放入摇床中37 ℃、220 rpm培养8～12 h。轻轻晃动培养的样品混合物，待混匀后吸取0.5 ml，分别转入装有4.5 ml的SC增菌液和TTB增菌液的摇管中，放在摇床中37 ℃、220 rpm培养18～24 h。用无菌的接种环分别蘸取SC和TTB增菌液，划线接种于XLD培养基，在37 ℃ 条件下培养24～48 h。

1.2.2 菌株鉴定 （1）微生物质谱鉴定挑取疑似沙门菌的黑色单菌落进行微生物质谱鉴定，对鉴定结果为沙门菌的菌落进一步纯化培养。（2）PCR鉴定按照试剂说明书提取细菌基因组DNA，利用PCR扩增固有基因FimW进行PCR扩增，引物序列（F：AACAGTCACTTTGAGCA TGGGTT；
R: GAGTGACTTTGTCTGCTCTTC A），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增体系共25 μl；
MIX 12.5 μl、DNA模板1 μl、上下游引物各1 μl、ddH2O 9.5 μl。反应程序：94 ℃ 4 min（预变性），94 ℃ 1 min，50 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共25个循环，72 ℃ 10 min（延伸）。PCR产物进行1 % 琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 沙门菌的血清型鉴定 根据沙门菌血清型测定盒的说明，分别进行菌体抗原和鞭毛抗原的检测。之后对比沙门菌抗原表确定被检沙门菌菌株的血清型。

1.2.4 药物敏感性试验 采用K-B药敏纸片法对宠物源沙门菌分离株进行抗生素敏感性检测。按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2016版[7]执行标准，判定结果为耐药（Resistance,R）、中介（Intermediate, I）或敏感（Susceptible,S）。大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株。

1.2.5 ESBLs表型检测 将分离株按0.5麦氏浓度均匀涂布到MH琼脂平板上进行ESBLs初筛与确证试验，具体操作按照文献[8]进行。质控菌株为大肠杆菌ATCC 25922。

1.2.6 耐药基因检测 利用提取的DNA，参照GenBank中耐药基因的序列及文献[9-11]，合成18对引物，分别扩增β-内酰胺类（blaSHV,blaOXA,blaCTX-M,blaTEM,blaPSE）、氨基糖苷类（aaC1,aaC2,aaC4,aaC3）、喹诺酮类（aac (6 ′)-Ibcr,qnrB,qnrA,qnrC,qnrD,oqxA,qnrS）、四环素类（tetA,tetB），以双蒸水做为阴性对照，沙门菌标准菌株（CVCC3377）作为阳性对照。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及退火温度见表1。

表1 耐药基因引物及退火温度

2.1 菌株的培养特征

XLD培养基上菌落形态呈现表面光滑凸出的黑芯菌落、边缘整齐、周围有一圈透明带（图1），判定为疑似沙门菌。

图1 分离株在XLD培养基上的生长

2.2 宠物源沙门菌分离鉴定结果

微生物质谱仪鉴定结果与PCR扩增结果均显示，从84份宠物犬、猫样品中分离到2株沙门菌，沙门菌的分离率为2.38 %。其中在35份健康的犬肛拭子中分离到2株为沙门菌，在23份腹泻犬和26份猫肛拭子样品中没有分离到沙门菌。微生物质谱鉴定结果见图2。

图2 分离菌株质谱鉴定结果

2.3 血清型鉴定结果

血清型结果显示1种沙门菌血清型，2株分离株（Y1、Y2）均为肠炎沙门菌。

2.4 药物敏感性结果

2株沙门菌对复方新诺明、多粘菌素B、氟苯尼考、庆大霉素、美罗培南、氨苄西林、恩诺沙星、阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟均表现为敏感。Y1对四环素和多西环素表现为中介，Y2对四环素、多西环素、头孢曲松表现为中介。2株沙门菌均对红霉素耐药（表2）。

表2 2株犬源沙门菌分离株对14种抗生素的耐药情况

2.5 ESBLs表型结果

产ESBLs初筛和确证实验显示，2株沙门菌均不产生ESBLs。

2.6 耐药基因结果

对2株沙门菌进行4类18种耐药基因检测，共检测到3类5种耐药基因。Y2菌株检测到β-内酰胺类中的blaCTX-M基因，氨基糖苷类中的aaC4基因，喹诺酮类中的qnrA，oqxA，aac(6 ′)-Ib- cr基因，四环素类基因中的tetA,tetB均未检测到。值得注意的是，Y1菌株不携带此18种耐药基因（表3）。

表3 2株沙门菌的血清型和耐药基因检测结果

沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，全世界目前已发现3 000多种血清型[12]。宠物作为沙门菌的重要宿主之一，其对人类健康的威胁也应该引起重视。特别是近年来宠物犬猫的饲养量不断增加，犬猫和人类的关系密切，共处家居环境，使宠物源沙门菌对公共卫生的影响不容忽视[13]。

细菌耐药性产生的原因较为复杂，可能会由于耐药基因的水平传播而携带耐药性。本研究从表观健康犬中分离到2株肠炎沙门菌。对2株肠炎沙门菌进行耐药表型和产ESBLs表型试验的结果显示，2株沙门菌的耐药谱相同，且均不产生ESBLs，提示这2株分离株具有相同或相近的来源。然而耐药基因结果显示，1株分离株携带3类5种不同耐药基因，1株分离株18种耐药基因检测结果均为阴性，这可能是由于不同环境、不同时间，耐药基因的流行和分布情况存在差异，同时，耐药基因的遗传特性、细菌耐药情况、不同耐药基因之间的相互作用等均可能会影响沙门菌对抗生素的耐药性。此外，本研究发现对大环内酯类抗生素耐药的分离株未检测到相关耐药基因，而携带耐药基因的沙门菌不一定对此类抗生素耐药，具体结果有待于进一步研究。本研究从84份犬、猫样品中分离到2株肠炎沙门菌，看似表观健康的犬，存在沙门菌感染情况，提示需要重视宠物来源人兽共患病原菌所带来的的潜在风险。