聚乳酸/细菌纤维素/壳聚糖多级结构纤维敷料的制备与表征

朱吉昌，张成霖，梅瑞娴，余西，王利环，于晖

（1.五邑大学 纺织材料与工程学院，广东 江门 529020；
2.五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门 529020）

皮肤是全身最大、最外层的器官，具有保护机体免受外部生物侵入、减弱外界机械损伤、体温调节、免疫调节、体内外物质交换等功能. 当受到严重创伤时，皮肤会失去自我修复能力，需要尽快地进行创伤修复. 皮肤创伤的愈合是一个复杂的生物学过程，包括急性炎症期、细胞增生期、瘢痕形成期、表皮及其他组织再生期四个阶段[1]，因此理想的创面敷料应满足渗出物快速吸收、创面水蒸气有效蒸发、创面维持等要求[2]. 传统的伤口敷料如纱布、棉绒、绷带等，基本上可以将伤口与外界环境隔离，提供干燥的愈合环境，但易导致继发感染等一系列并发症. 现代创面敷料如水凝胶[3]、水胶体[4]、海绵[5]、半透膜[6]，在防止创面脱水进而促进创面愈合方面取得了显著进展，但这些敷料在防水性、透气性、吸附能力和延展性等方面各有欠缺：半透膜敷料能够阻隔环境微生物感染，具有良好的保湿性，但吸收渗液能力差，不适用于感染伤口[7]；
水凝胶和水胶体敷料能够加速干性焦痂伤口的愈合，但不适用于感染伤口和严重渗液伤口[8-9]；
海绵孔隙率高，具有良好的吸收渗液的能力，但保湿性差，不适用于三度烧伤或干性焦痂伤口[10]. 因此，目前没有完美的敷料产品能够实现伤口的全程修复.

基于组织工程技术原理，开发类似细胞外基质具有的多级结构的新型三维敷料，能为皮肤再生提供一个潜在的解决方案. 由于细胞外基质具有微米至纳米尺度的纤维状结构，因此由微米纤维和纳米纤维构筑的复合纤维敷料被认为是理想的伤口敷料材料[11-14]. 静电纺丝技术制备的纤维直径在几百纳米至几个微米之间，被认为能够模拟细胞外基质的纤维状结构. 然而，由静电纺丝技术制备的纳米纤维通常是致密的二维层状膜[15]，厚度小、液体吸附能力差，适用于无渗出或低渗出创面，不适用于渗出性创面或深创面. 为此，构建孔隙率高、透气性好，同时又具有优异吸水性能的三维纤维敷料来修复皮肤组织，成为了皮肤组织工程的研究热点之一. Wen 等[16]利用改良的气体发泡技术制备了壳聚糖/聚乙烯醇复合三维层状纳米纤维海绵，用于止血和伤口愈合，这种三维层状海绵能够吸收约 60 倍自身质量的溶液，体内研究表明，三维层状纳米纤维结构有利于创面愈合，以及早期功能真皮和脂肪细胞的再生，且疤痕面积相对较小. Tan 等[17]通过液体接收静电纺纤维，成功制备了聚乳酸三维纤维伤口修复材料，该材料具有5 20 μm～相互连通的孔隙，可以使人皮肤成纤维细胞长入其中. 本研究通过纤维均质分散-冷冻干燥技术与静电纺丝技术的结合，将微米尺度的聚乳酸（PLA）纤维、纳米尺度的细菌纤维素（BC）纤维通过壳聚糖（CS）粘结，构建成具有三维连通孔结构的多级结构纤维敷料，以期用于皮肤创伤的有效修复.

1.1 实验材料

N,N-二甲基甲酰胺（DMF，西陇科学股份有限公司）；
二氯甲烷（ C H2Cl2，上海麦克林生化有限公司）；
聚乳酸（PLA，浙江海正生物材料有限公司）；
细菌纤维素（BC，海南亿德食品有限公司）；
壳聚糖（CS，上海阿拉丁生化技术有限公司）；
乙酸（HAc，广州化学试剂厂）；
无水乙醇（ C H3C H2OH，广东光华科技股份有限公司）；
L929 小鼠成纤维细胞（武汉普诺赛生物科技有限公司）；
L929 细胞专用培养基（MEM，武汉普诺赛生物科技有限公司）；
胰酶溶液（上海宏生生物科技股份有限公司）；
活/死细胞双染色试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）；
细胞计数试剂盒（CCK-8，上海碧云天生物技术有限公司）；
4,6′ -二脒基 2- -苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技术有限公司）；
iFluorTM 488标记鬼笔环肽（翌圣生物科技上海股份有限公司）；
Triton X-100（翌圣生物科技上海股份有限公司）；
磷酸盐（PBS）粉末（Ubio Technology）；
多聚甲醛（上海麦克林生化科技有限公司）.

1.2 实验仪器

PL - 2 03-电子天平（博特勒托利多仪器上海有限公司），82 - 5-磁力搅拌器（常州普天仪器制备有限公司），FJ2009-数显高速分散均质机（上海索映仪器设备有限公司），Visco - 0 70-旋转流变仪（中美合资技术有限公司），DXE - 3-静电纺丝机（上海巡腾纳米科技有限公司），GZX - 9 240-电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），BDF - 2 5H110-超低温冰箱（海信容声广东冰箱有限公司），2 - 4 LDplus -冷冻干燥机（上海莱景科学仪器有限公司），Sigma500-扫描电子显微镜（SEM，蔡司股份公司），YG601H - III-透湿仪（泉州宁纺仪器有限公司），LD - 2 3.503-万能材料试验机（深圳市兰博三思材料检测有限公司），CFP - 1 100A-多孔材料孔径分析仪（美国 PMI 公司），BIO - R AD - i Mark 酶标仪（北京迈润医疗医疗器械有限公司）， B B - 1 50 - C O2培养箱（塞默飞世尔苏州仪器有限公司），IX73-荧光倒置显微镜（奥林巴斯公司），DMi8-共聚焦荧光显微镜（徕卡仪器有限公司）.

1.3 样品制备

静电纺丝过程参数为：灌注速度1 mL/h，电压强度20 kV，接收距离20 cm，滚筒转速50 r/min，环境温度(20 ±5)°C，相对湿度为(50 ±5) %. 利用静电纺丝方法制备PLA 微米纤维后，配置质量分数为10%的PLA 微米纤维纺丝液（称取5.8 g 的PLA 颗粒，加入质量比为 2 :8的 D MF/CH2C l2混合溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌2 h）.

质量分数 1%PLA 微米纤维分散液的制备：PLA 纤维置于真空干燥箱60°C干燥24 h 后，称取2 g PLA 微米纤维膜，裁剪为5 mm ×5 mm大小，加入198 g 超纯水中，利用高速分散均质机以20 000 r/min 的速度均质分散10 min 即得.

质量分数1%BC 纳米纤维分散液的制备：BC 加入质量分数为1%的NaOH 溶液中浸泡24 h 后，放在滤网上用超纯水冲洗，反复冲洗至pH 值中性，烘干备用. 称取2 g 的BC，加入超纯水至200 g，利用高速分散均质机以20 000 r/min 的速度均质分散10 min 即得.

质量分数 1%CS 溶液的制备：称取 CS 粉末1 g，加入到99 g 质量分数 1%的醋酸水溶液中，放置在磁力搅拌器上搅拌60 min 即得.

将配置好的 PLA 微米纤维分散液、BC 纳米纤维分散液和 CS 溶液按质量比分别为 7 : 3 :0.1、7 : 3 :0.2、7 : 3 :0.5、3 : 7 :0.2 和 5 : 5 :0.2 等5 种比例混合后，用磁力搅拌器搅拌1 h，使其混合均匀. 分别取这5 种质量比的混合液加入模具中，置于 - 8 0°C的冰箱冰冻成型，再冷冻干燥24 h，得到干态的PLA/BC/CS 多级结构纤维敷料.

1.4 测试与表征

采用电子扫描显微镜（SEM）对PLA 微米纤维、BC 纳米纤维及PLA/BC/CS 多级纤维敷料的微观结构进行观察与表征. PLA/BC/CS 混合分散液的黏度由旋转流变仪进行测试. 敷料透湿气性由透湿仪进行测试.

敷料的力学性能在水中进行，用万能材料试验机进行压缩测试，压缩速率为1 mm/min，压缩应变为80%.

敷料的生物相容性实验：首先将敷料用 75%乙醇和紫外光照灭菌，无菌 PBS 清洗干净后置于96 孔板中，将L929 株成纤维细胞悬液接种于敷料上，每孔个细胞，每孔加入100 μL 培养基，放入为5%的培养箱，培养条件为37培养基每2 天更换一次. 敷料上细胞的活性使用进行测试（具体操作步骤根据商品操作说明进行）；
细胞的活/死状态使用活/死细胞双染色试剂盒进行染色表征（具体操作步骤根据商品操作说明进行）；
细胞在支架上的粘附形态分别使用鬼笔环肽染色和SEM 表征.

2.1 纤维和敷料的形貌与结构

通过扫描电镜对 PLA 和 BC 两种纤维进行观察，如图 1 所示，采用静电纺丝技术制备的 PLA纤维表面光滑，直径分布在，具有微米级尺度；
BC 纤维直径分布在，具有纳米级尺度，满足构筑多级结构纤维敷料的尺度要求.

图1 PLA 纤维和BC 纤维的SEM 图像与直径分布

经均质分散-冷冻干燥技术制备得到的PLA/BC/CS 多级纤维敷料的实物图、微观形貌如图2 所示：5 种PLA/BC/CS 混合比的浆液均能通过冷冻干燥获得形状结构稳定的三维敷料，敷料内部均具有类似海绵的连通多孔结构，其中PLA 微米纤维在整个三维结构中起到“骨架”支撑作用，形成微米级的大孔结构；
BC 纳米纤维则“填充”在孔壁上，模拟细胞外基质的纳米纤维状结构；
CS 的加入起到粘合作用，使三维结构保持一定的稳定性.

图2 不同比例敷料的宏观与微观形貌图

理想的生物医用敷料内部的三维孔状结构不仅可以为伤口渗液的吸收提供储存空间，同时还为伤口与外界的物质交换提供“通道”，因此敷料的孔径对伤口的愈合有着重要意义. 表1 展示了不同比例 PLA/BC/CS 多级纤维敷料的孔径分布数据：1）当敷料中 PLA 与 BC 的比例不变时，随着 CS的含量从0.1、0.2 增加到0.5，其平均孔径由169 μm 依次降低到119 μm、106 μm，这主要是因为CS附着在 PLA 与 BC 纤维表面，随着其含量增加，黏度也随着增大（具体见表 1：混合液的黏度由(456.4 ±41.3) m m2/s ，依次增加到 ( 852.4 ±49.8) m m2/s、(2 075.8 ±108.9) m m2/s ），从而导致冷冻过程中冰晶的生长受到抑制，最终导致敷料孔径减小. 2）当CS 含量不变时，随着BC 比例的增加，溶液的黏度也增加，导致敷料孔径减小.

表1 不同比例PLA/BC/CS 敷料的孔径与分散液的黏度

2.2 多极结构敷料的物化性能

敷料对创面环境的保湿程度可以通过敷料的含水率进行表征. 表2 数据显示：1）当敷料中PLA与 BC 的比例不变时，随着 CS 比例从 0.1、0.2 增加到 0.5，敷料的含水率由(31.9±1.0)%依次上升至(34.6±0.6%)、(38.2±0.5)%，这主要归功于CS 良好的吸水溶胀性能，但整体变化幅度较小；
2）当CS 配比不变时，随着BC 纳米纤维占比的增加，其含水率上升幅度显著，这主要是BC 良好的吸水溶胀性能导致的. 因此针对疤痕形成期的伤口，可以通过提高BC 纳米纤维和CS 的比例来维持创面的湿度.

为避免炎症期伤口的溃烂，理想的医用敷料应具有良好的透湿气性. 如表 2 所示：5 种敷料都表现出良好的透湿性能，其透湿量均大于210 000 g(/ m )d· . 结合敷料的孔径和吸水性能发现，敷料的透湿性随孔径的增大而增大、随含水率的增大而减小，因此孔径大、含水率小的敷料透湿性更好，更适合炎症期伤口的修复.

敷料在使用过程中会吸收伤口的渗出液，由于敷料本身材质与结构等原因，一些敷料会产生不同程度的体积变化，从而影响实际的使用效果. 敷料的结构稳定性是衡量敷料使用性能的重要指标之一，本研究对多级结构纤维敷料吸水后的体积收缩率进行了测试. 表 2 数据显示：1）当敷料中PLA 微米纤维与BC 纳米纤维的比例不变时，随着CS 比例从0.1、0.2 增加到0.5，敷料的体积收缩率由(32.0±0.8)%依次减小到(27.2±0.7)%、(19.4±1.0)%，这表明黏合剂CS 含量增加，敷料的稳定性更好，同时CS 在水中也会发生一定的溶胀，从而减弱体积收缩带来的影响；
而CS 含量较低时，敷料孔径结构不稳定，敷料吸水后易产生收缩. 2）当CS 配比不变时，随着BC 的增加，敷料的孔径减小，原因是BC 比PLA 的吸水溶胀性能好，BC 增加其体积收缩逐渐降低.

伤口在愈合初期会产生大量的渗液，因此敷料需具有优异的吸收渗液能力. 本研究中敷料吸收渗液的能力用敷料的吸水性能来表征. 敷料的理论吸水率受敷料吸水后的体积收缩率和干态体积密度的影响（不同比例的PLA/BC/CS 敷料的理论体积密度均为10 mg/cm3）. 计算结果如表 2 所示：多级结构纤维敷料最低的吸水率都可达到6 790%，即敷料至少能够吸收自身重量67.9 倍的水量，完全能够满足高渗液伤口的需要.

表2 不同比例敷料的含水率、透湿量、体积收缩率和理论吸水率数据

对于皮肤组织工程来说，当皮肤的某处部位发生缺失时，覆盖的敷料会由于机体弯曲而承受张力，因此敷料需要具有一定的力学性能.本实验利用万能力学试验机对多级结构纤维敷料的压缩进行了表征. 从表 3 的最大压缩应力（应变为80%）和5 个压缩循环后的压缩形变数据可以看出：1）当敷料中 PLA 与 BC 的比例不变时，随着CS 比例从0.1、0.2 增加到0.5，敷料的最大应力逐渐增大，最高（13.8±0.1）kPa，但其 5 个压缩循环后的形变无显著性差异. 产生这一现象的原因应该是随着 CS 含量的增大，敷料的体积密度相应增大，从而使压缩应力增大. 2）在CS 含量不变，调节PLA 微米纤维与BC 纳米纤维的比例时，敷料的压缩应力逐渐减小，这是由于 PLA 在敷料中起到支撑作用，而随着PLA 含量的减小，敷料的压缩应力也随着减少；
而压缩形变随 BC 纳米纤维比例的提高而逐渐减小，这是因为BC 在水中良好的溶胀性赋予了敷料良好的回弹性，从而使压缩形变减小.

表3 多级结构纤维敷料的压缩性能

2.3 多级结构纤维敷料的生物相容性

敷料的生物相容性决定了敷料的实际应用. 为了测试其生物相容性，本研究采用了CCK-8 试剂盒和活/死细胞染色对接种在 7PLA/3BC/0.2CS、5PLA/5BC/0.2CS、3PLA/7BC/0.2CS 敷料上的细胞的增殖能力和活/死状态进行了表征.

图3 的测试结果显示：接种在3 种敷料上的L929 细胞均具有良好的增殖能力；
随着培养时间的增加，3 种敷料上的细胞均呈现为指数增长，表明3 种敷料均具有良好的生物相容性. 相比之下，当细胞培养到第 3 至第 7 天时，培养在 7PLA/3BC/0.2CS 敷料上的细胞增殖能力最强，并且与培养时间正相关.

图4 的细胞活/死染色结果同样显示：接种在3 种敷料上的L929 细胞的数目随培养时间的延长成倍增长，并在各个时间段均呈现超过90%的细胞存活率（绿色），且在7PLA/3BC/0.2CS 敷料上的细胞密度最大. 这可能是7PLA/3BC/ 0.2CS 敷料三维结构中的孔径更大，便于营养物质和代谢物质的交换，为细胞的增殖提供了更大的空间，从而更有利于细胞的增殖和伤口的愈合.

图4 敷料生物相容性的活/死细胞染色荧光图像

为了进一步分析促进细胞在 7PLA/3BC/0.2CS 增殖的原因，对接种在 7PLA/3BC/0.2CS、5PLA/5BC/0.2CS 和3PLA/7BC/0.2CS 敷料上培养了3 天的细胞形态结构进行了表征. 由图5 的细胞骨架染色结果以及SEM 图像可知，在7PLA/3BC/0.2CS 敷料上培养的细胞呈现良好的伸展状态，在5PLA/5BC/0.2CS 敷料培养的细胞伸展幅度较小，而在3PLA/7BC/0.2CS 敷料培养的伸展最差，呈球状. 出现该现象主要原因是随着PLA 微米纤维含量的增加，敷料的亲水性减弱，更有利于细胞的粘附和伸展，而细胞的粘附和伸展进一步促进了细胞的增殖，从而使 7PLA/3BC/0.2CS 敷料更有利于伤口的修复.

图5 L929 细胞在不同比例敷料上培养3 天后的细胞形态荧光染色图像和SEM 图像

2.4 敷料的舒适性能展示

舒适性反映了敷料适应人体形状和运动的能力，当敷料易于伸展并能基本返回原位时，能防止皮下剪切损伤，患者也会感觉舒适. 如图 6 所示，贴敷于手腕处的 7PLA/3BC/0.2CS 多级结构纤维敷料在经过弯曲使用后仍能保持弯曲前的形状，并且能够贴合皮肤. 该敷料的舒适性主要归功于PLA/BC/CS 敷料中多级纤维的三维网状结构和CS 的紧密粘合作用.

图6 敷料舒适性能展示

通过纤维均质分散-冷冻干燥技术制备的PLA/BC/CS 敷料同时具有上百微米的大孔结构、微米以及纳米尺度的纤维结构，高度模拟了细胞外基质的多级结构. PLA/BC/CS 多级结构纤维敷料兼具良好的吸水性、透湿性、保湿性，以及良好的生物相容性，其上细胞增殖及伸展效果良好.

敷料中壳聚糖的加入对其抗菌功效的影响尚待研究，通过微米PLA 纤维和纳米BC 纤维搭建的多级纤维结构来模拟细胞外基质的多级结构，为创面敷料的制备提供了一种新的思路和方法，而该敷料在不同的创口环境中功能性的应用还需要继续深入研究.