鞍带石斑鱼Epinephelus,lanceolatus卵子的短期保存*

魏千皓，叶智锋，王崇伟，林浩然，李水生，张勇

有害生物控制与资源利用国家重点实验室/广东省水生经济动物良种繁育重点实验室/中山大学生命科学学院，广东 广州 510275

鞍带石斑鱼Epinephelus lanceolatus隶属鲈形目，鮨科，石斑鱼属，主要分布于印度-太平洋地区，是大型的珊瑚礁鱼类。目前报道最大的鞍带石斑鱼个体长达2.7 m，体质量可达400 kg［1］。鞍带石斑鱼生长速度快，味道鲜美，是我国和东南亚国家重要的海水养殖鱼类。然而，鞍带石斑鱼人工繁殖难度大，受精卵价格昂贵。近年来，每公斤受精卵的价格在3 万～6 万元之间，仍供不应求。鞍带石斑鱼的卵子主要通过激素催产获得，其活力在接触海水后迅速下降，从而导致受精失败。配子保存是提高鱼类人工繁育效率的有效策略。目前，鞍带石斑鱼精子的长期保存研究已经开展［2-3］。冷冻保存后的精子已应用于不同石斑鱼的种间杂交［4-5］。但是，鞍带石斑鱼卵子保存的研究尚未见报道。

由于鱼类卵子的结构复杂，很难像精子一样进行长期保存，相较而言，短期的体外保存是可行的途径。在金鱼、鲤鱼、虹鳟、小体鲟和梭鲈等鱼类中，已经开展了卵子的短期保存研究［6-11］，发现体外保存的卵子在数小时至数天内仍能保持较高的活力。对于生产和科研工作来说，短期内保持卵子活力有助于人工授精和孵化管理，可提高人工繁育的效率。为了保持鞍带石斑鱼卵子的活力和延长体外保存的时间，本研究对卵子体外保存的条件进行研究，建立适用于鞍带石斑鱼卵子体外保存的方法。

1.1 配子收集

鞍带石斑鱼的卵子采集于海南晨海水产有限公司感城养殖基地。于2020 年6～10 月，选择处于生殖季节、腹部隆起、生殖孔红肿凸起的鞍带石斑鱼亲鱼（10～12 龄，体质量60～70 kg），在人工催产后，通过挤压腹部使精子或卵子流出。将精液收集于50 mL 离心管中，然后4 ℃储存直至使用。将卵子收集于干燥洁净的500 mL玻璃烧杯中，然后分别放置于塑料培养皿中进行实验。

1.2 受精实验

将精子和卵子置于烧杯中轻轻混合，然后加入过滤海水激活精子与卵子。3 min 后，用干净的海水清洗受精卵两次，然后转移至装有10 L 的海水塑料桶中。在培育的过程中，保持充气。培育4 h 后，待受精卵发育至囊胚期，在解剖显微镜下观察，计算受精率［（受精率=（受精卵总数/卵子总数）×100%，n=1 000颗］。培育20 h后，在解剖显微镜下观察，计算孵化率［孵化率=（孵化幼鱼总数/卵子总数）×100%，n=1 000颗）。

1.3 实验设计

以逐步进行的方式设计了6个实验。每个实验设3个重复，每个重复卵子总数为n=1 000颗。

1.3.1 卵子保存培养基的确定 以无酚红的Leibovitz"s L-15（L-15）培养基、Dulbecco"s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 （DMEM/F12）培养基、 Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI-1640）培养基、DMEM 培养基作为基础保存液。以上培养基购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。卵子和培养基大约按1∶6 的比例混合，28 ℃放置2 h，然后检测卵子的受精率与孵化率。

1.3.2 保存温度的测定 根据实验1 的结果，将卵子置于L-15 培养基中，在不同温度（16、22、28和32 ℃）下保存2 h，然后检测卵子的受精率与孵化率。

1.3.3 培养基pH 值的测定 为了确定卵子保存的最佳培养基pH 值，根据实验1 和2 的结果，将卵子分别放置在pH 值为7.4、7.8、8.1、8.5的L-15 培养基中。2 h 后，检测卵子的受精率与孵化率。

1.3.4 保存时间对卵子活力的影响 根据实验1、2 和3 的结果，将卵子保存在22 ℃的L-15 培养基（pH=8.1）中，分别在不同的保存时间（0、1、2、4 和6 h）后检测卵子的受精卵与孵化率。

1.3.5 不同血清对卵子活力的影响 为了延长卵子保存的时间，将不同剂量的胎牛血清（FBS，fetal bovine serum）和鞍带石斑鱼血清（GGS，giant grouper serum）分别添加进L-15 培养基（pH=8.1）中。然后，将卵子置于含有血清的L-15 培养基中，22 ℃保存4 h，检测卵子的受精卵与孵化率。鞍带石斑鱼血液样品采集于处在繁殖季节的亲鱼，4 ℃以8 000×g速度离心15 min，分离血清样品，放置-80 ℃冰箱储存。

1.3.6 维生素预混料对卵子活力的影响 基于上述的实验结果，为了进一步延长卵子保存的时间，将20 mg/L 维生素预混料（厦门惠盈动物科技有限公司）添加入含有0.1 μL/mL鞍带石斑鱼血清的L-15 培养基（pH=8.1）中。然后，将卵子置于添加维生素的培养基中，22 ℃时分别在0、2 、4 、6和8 h后检测卵子的受精率和孵化率。

1.4 统计分析

实验结果采用SPSS 23.0（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计分析。所有数据均表示为平均值±S.E.M.。百分比数据在反正弦变换后进行单因素方差分析检验各组之间差异性，利用Fisher的最小显著性差异法（LSD）进行多重比较，取P<0.05为显著性标准。

2.1 卵子短期保存条件的优化

刚挤出来的卵子，不经过保存立即授精，其受精率和孵化率分别为（75.6±5.31）%和（59.7±6.92）%（表1）。而未受精的卵子在28 ℃下直接暴露于空气中2 h，则完全失去活力。在28 ℃下，卵子在不同培养基中保存2 h 后，活力出现了显著下降，受精率均低于50%（表1）。与在其他培养基中保存的卵子相比，在L-15 培养基中保存的卵子具有相对较高的受精率［（44.2±0.73）%］和较高的孵化率［（25.4±2.42）%］（表1）；
表明L-15 培养基可能更适合作为卵子保存的培养液。在L-15 培养基中，保存温度为16 ℃和22 ℃时，卵子的受精率和孵化率明显高于28 ℃和32 ℃保存的卵子（表2）。由于卵子22 °C 保存后的受精率和孵化率高于16 ℃保存后的受精率和孵化率，因此选择22.0 ℃作为后续实验的保存温度。随着pH 从7.4 升高到8.1，受精率与孵化率有增加的趋势，但是统计数值没有显著差异（表3）。然而，由表3 可知，在培养基pH=8.1 时，保存后卵子的受精率和孵化率明显高于在pH=8.4 时的受精率和孵化率。基于上述结果，组合优化好的保存条件（22 ℃，pH=8.1 的L-15 培养基），对卵子体外保存的时间进行测试，结果见图1。图1显示，卵子在保存液中2 h后，其受精率和孵化率分别为（66.4±2.70）%和（47.9±1.28）%；
4 h 后，分 别 降 至（45.6±2.05）%和（25.8±1.67）%；
6 h 后，分别降至（25.3±1.67）%和（11.6±1.06）%。

表1 鞍带石斑鱼卵子28 ℃时在不同培养基中保存2 h后的受精率和孵化率1）Table 1 Fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in different media at 28 ℃for 2 h

表2 温度对鞍带石斑鱼卵子在L-15培养基中保存2 h后的受精率和孵化率的影响1）Table 2 Effects of temperatures on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium for 2 h

表3 鞍带石斑鱼卵子22 ℃时在不同pH值的L-15培养基中保存2 h后的受精率和孵化率1）Table 3 Effects of pH on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 2 h

2.2 添加剂对卵子短期保存的影响

为了延长卵子保存时间，在L-15 培养基中分别添加FBS 和GSS。如表4 所示，当添加FBS 时，几乎所有卵子都在保存4 h 后失去活力。而添加GSS 可以显著提高卵子的活力。在含有0.1 μL/mL GGS的L-15培养基中，保存4 h后的卵子的受精率与孵化率分别为（67.6±2.88）%和（46.3±0.68）%（表4）。将20 mg/L 的维生素预混物添加进含有0.1 μL/mL GGS 的L-15 培养基中，卵子保存的时间得到了明显地提高。在保存8 h 后，卵子的受精率 和 孵 化 率 分 别 为（64.4±1.87）% 和（44.8±1.76）%，与4 h 和6 h 时的数值没有显著性差异，低于对照组（图2）。

图2 22 ℃L-15培养基（pH=8.1）添加鞍带石斑鱼血清和维生素预混料后，卵子不同保存时间后的受精率和孵化率Fig.2 The fertilization and hatching rates of giant grouper eggs at different storage time points in L-15 medium(pH=8.1)with supplementation GGS and vitamin premix at 22 ℃

表4 鞍带石斑鱼卵子22 ℃时在含不同血清的L-15培养基中保存4 h后的受精率和孵化率1）Table 4 Effects of sera supplementation on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 4 h

3.1 卵子保存的基础培养基探讨

本研究首先对鞍带石斑鱼卵子体外保存的培养液进行探讨。L-15、DMEM/F12、RPMI-1640 和DMEM 培养基常用于动物细胞培养。我们对这4种培养基进行了测试，结果表明，卵子保存在L-15培养基中具有较高的受精率和孵化率（表1）。L-15是鱼类卵母细胞培养常用的培养基，具有维持卵母细胞活力的功能［12-14］。我们先前的研究亦表明，在L-15 培养基中，斜带石斑鱼的卵泡经类固醇激素诱导后可以发生生发泡破裂；
卵母细胞可以正常恢复第一次减数分裂［15-16］。这些研究表明，L-15可用为石斑鱼卵子保存的基础培养基。

3.2 温度和pH对卵子保存的影响

温度是影响卵子保存效率的关键因素。不同鱼类的卵子对保存温度的要求有很大的差别。有研究推测，保存温度可能与鱼类栖息地的温度有关。冷水性鱼类的卵子比暖水性鱼类的卵子更能耐受较低的保存温度［8，17-18］。鞍带石斑鱼是一种热带鱼类。在海南省，其繁殖最适水温为28～32 ℃。我们的结果表明，当保存温度为16 ℃和22 ℃时，卵子拥有较高的受精率和孵化率。因此，鞍带石斑鱼卵子保存的适合温度为16 ～22 ℃。卵子保存的最适温度低于养殖的最适温度的现象在其他鱼类中也被观察到。例如，小体鲟亲鱼在15 ℃下养殖，但卵子保存的适合温度在7～11 ℃［8］。克林雷氏鲶的卵母细胞保存温度为15 ℃，但亲鱼繁殖的水温为25 ℃［19］。目前，关于卵子保存温度低于亲本养殖温度的原因仍然未知。我们推测较低的温度可能会降低卵细胞内的代谢活动，从而有助于维持卵子的活力。多项研究发现，pH 值的变化也会影响体外保存的卵子的活力［10，20-21］。虹鳟卵子在pH=8.2 的培养基中保存3 d 后的受精率高于在pH=9 和pH=10 的培养基中［10］。我们的研究发现，当卵子保存在pH=8.5 的L-15 培养基中，其活力显著降低，但在pH 为7.4、7.8 和8.1 的培养基中，卵子的受精率和孵化率差异不显著（表3）。由于pH 为8.1 时，保存后卵子的受精率和孵化率最高，因此建议鞍带石斑鱼卵子保存在pH=8.1 的培养基中。根据优化的保存条件，在22 ℃下，卵子在L-15培养基（pH=8.1）中保存2 h后的受精率和孵化率分别为66.4%和47.9%（图1），相比在未优化条件下，分别提高了22.2%和22.5%（见表1）。尽管如此，随着保存时间的延长，卵子的活力仍急剧下降。在体外保存超过4 h 后，卵子的受精率和孵化率均显著降低。

3.3 血清在卵子保存中的作用

因血清含有许多细胞生长必需的营养物质，被广泛用于细胞培养。为了延长鞍带石斑鱼卵子保存的时间，我们尝试在L-15 培养基中分别添加FBS 和GGS。结果表明，添加FBS 对鞍带石斑鱼卵子保存不利。在添加FBS 培养基中，我们观察到卵子内部含有分散的油球。油球被认为是海洋鱼类漂浮性卵子质量的重要指标［22-23］。在石斑鱼卵母细胞成熟过程中，众多小油球逐渐融合成一个较大的油球［15-16，24］。含有多油球的卵子其受精率显著下降和孵化率低下［25］。在此，因FBS 添加而引起卵子内形成多油球现象的原因尚不清楚。卵子在添加GGS的L-15培养基中保存4 h后，受精率和孵化率都有了显著的提高。在梭鲈、露斯塔野鲮和小体鲟中，利用卵巢液成功地建立了卵子短期保存系统［8，11，26］。这些研究表明，鱼类体液适合维持卵子的活力，有助于延长保存的时间。此外，本研究还发现补充维生素预混料可有效地延长卵子的保存时间。在保存8 h 后，卵子的受精率仍保持在60%以上。研究表明，维生素对亲鱼的繁殖性能和卵子质量起着关键作用［27］。在亲鱼培育中，通常在饲料中补充维生素以促进卵子发育。然而，维生素对体外卵子保存的作用尚不清楚。一些维生素具有抗氧化的功能，在卵子保存过程中可能起到减少氧化反应的作用。

综上所述，我们成功地建立了鞍带石斑鱼卵子体外短期保存的方法。保存温度为22 ℃时，在添加鞍带石斑鱼血清和维生素的L-15 培养基（pH=8.1）中，卵子可以在体外进行短期的保存（约8 h）。该保存系统有助于提升鞍带石斑鱼的人工繁育、孵化管理和杂交试验等生产实践的效率。