芪珠升白口服液多指标成分测定及质量评价,*

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；
2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046；
3.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712046；
4.陕西中医药大学制药厂，陕西 咸阳 712083)

芪珠升白口服液是陕西中医药大学附属医院在长期临床实践基础上，结合民间使用经验，选用黄芪、女贞子、珠子参、当归、灵芝、甘草制成的一种用于放化疗致白细胞减少的复方中药制剂，具有升高白细胞、增强机体免疫功能的作用[1-4]。目前对其研究主要包括升高白细胞和改善免疫功能等药效学的初步研究[5]，未对其进行定性、定量分析，难以准确控制其质量。本研究采用薄层色谱法对黄芪、珠子参、当归进行定性鉴别；
采用高效液相色谱(HPLC)法对女贞子中活性成分特女贞苷，珠子参中活性成分人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa，甘草中活性成分甘草酸进行定量分析，并参照2020年版《中国药典》(四部)对芪珠升白口服液的相对密度、pH值等进行测定[6]，以期为芪珠升白口服液的质量控制提供参考。

1.1仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪(包括自动进样器，四元泵，柱温箱，2998PDA 检测器)；
SQ8200HD型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)；
HH-2型恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；
GB204型电子天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；
远红外辐热炉(米技电子电器上海有限公司)。

1.2试药 黄芪、珠子参、女贞子、当归、灵芝、甘草饮片均购自陕西兴盛德药业有限责任公司，经检验均符合陕西省中药饮片标准；
特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵(批号分别为HS19515S1、HS19115B2、HS19215B1、HM19115S2，宝鸡辰光生物科技有限公司，含量：98%)；
黄芪甲苷(批号：0781-20008,中国食品药品检定研究院)；
色谱乙腈、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)；
D101大孔树脂(批号：170625,上海蓝季科技发展有限公司)；
硅胶G板(批号：20190903,青岛海洋化工有限公司)。

2.1含量测定

2.1.1色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，洗脱程序(0～25 min，15%～20%A；
25～37 min，20%～25%A；
37～52 min，25%～30%；
52～55 min，30%～35%，55～60 min，35%～40%；
60～70 min，40%～42%)；
检测波长203 nm；
流速1.0 mL·min-1；
进样量10 μL；
柱温30 ℃。

2.1.2混合对照品溶液的制备 分别取特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇10 mL，制成特女贞苷1.708 mg·mL-1、人参皂苷Ro 1.00 mg·mL-1、竹节参皂苷Ⅳa 0.856 mg·mL-1、甘草酸0.856 mg·mL-1的混合对照品溶液。(10 ℃以下保存)。

2.1.3供试品溶液的制备 取口服液2 mL，通过D101大孔树脂(内径为1.5 cm,柱高为30 cm),依次用2BV水，3BV 20%乙醇，5BV 60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用。

2.1.4阴性样品溶液的制备 按处方比例及生产工艺分别制备不含女贞子、珠子参、甘草药材的口服液阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5专属性考察 取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，阴性无干扰。结果见图1。

A.供试品溶液；
B.对照品溶液；
C～E.女贞子、珠子参、甘草阴性对照溶液；
1.特女贞苷；
2.人参皂苷Ro；
3.竹节参皂苷Ⅳa；
4.甘草酸铵

2.1.6线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下制备好的混合对照品溶液2.0 mL、1.5 mL、1.0 mL、0.5 mL、0.2 mL置2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。在“2.1.1”项下条件测定峰面积，以对照品质量浓度(X)与峰面积(Y)作标准曲线，得回归方程，结果见表1。

表1 4种指标成分的线性范围考察结果

2.1.7精密度实验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，结果特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.41%、0.58%、0.98%、1.09%。表明该仪器精密度良好。

2.1.8重复性实验 精密移取同一批口服液样品(批号：210301)2 mL，按“2.1.3”项下方法制备，平行6份，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪测定，特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵平均含量分别为0.704 mg·mL-1、0.745 mg·mL-1、0.595 mg·mL-1、0.432 mg·mL-1，RSD分别为1.66%、2.06%、2.02%、1.79%，表明本方法重复性良好。

2.1.9稳定性实验 取口服液(批号：210301)，按“2.1.3”项下方法制备，分别在0,3,6,9,12和24 h按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵峰面积的RSD为1.44%、1.32%、1.87%、2.01%，表明本品24 h内稳定性良好。

2.1.10加样回收率实验 取重复性试验项下的样品1 mL，平行6份，精密加入特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵对照品适量，再按“2.1.3”项下方法制备，测定含量，平均回收率分别为98.26%、95.90%、95.76%、98.09%，RSD分别为1.68%、2.78%、1.84%、2.58%，表明回收率良好。结果见表2。

表2 回收率实验结果(n=6)

2.1.11耐用性实验 本实验考察了Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和ThermoBDS Hypersil C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，各组分均能够达到较理想分离度，该方法耐用性良好。

2.1.12样品含量测定 取8批口服液，按“2.1.3”项下方法制备，按“2.1.1”项下条件测定。结果见表3。计算8批样品中特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵的平均含量分别为0.683 mg·mL-1、0.718 mg·mL-1、0.605 mg·mL-1、0.540 mg·mL-1。

表3 含量测定结果(n=2)

2.2TLC法定性鉴别

2.2.1黄芪TLC鉴别 参照文献[7]和2020年版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法[8]，取口服液20 mL，加水饱和正丁醇萃取2次，每次20 mL，弃去下层水液，合并2次正丁醇液，再以氨试液洗涤2次，每次20 mL，弃去下层氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解后，制成供试品溶液；
按照处方比例取5 g，相同口服液制备工艺制成缺黄芪的样品，同法制成阴性对照溶液；
另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(15∶7∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同棕褐色斑点；
紫外光下显相同颜色的橙黄色荧光斑点。结果见图2。阴性无干扰，斑点分离较好。

A B

2.2.2珠子参TLC鉴别 参照文献[9]和2020年版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法[8]，取口服液5 mL，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5mL加热使溶解，作为供试品溶液；
按照处方比例取5 g，相同口服液制备工艺制成缺珠子参的样品，同法制成阴性对照溶液；
对照药材1 g，加水30 mL回流1 h，滤过，滤液浓缩至10 mL同法制成对照药材溶液；
另取人参皂苷Ro对照品适量，加甲醇制成每1 mL含2 mg的对照品溶液。吸取上述四种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(15∶10∶0.5∶0.3∶2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰，在紫外光(365 nm)下检视。结果见图3。在与对照品色谱相应的位置上，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰，斑点分离较好。

1～3.供试品溶液;4.对照药材溶液;5.人参皂苷Ro;6.阴性对照溶液

2.2.3当归TLC鉴别 参照2020年版《中国药典》一部当归项下薄层色谱鉴别[10]和2020年版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法[8]，取口服液10 mL，用乙醚振摇提取两次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；
按照处方比例取5 g，相同口服液制备工艺制成缺当归的样品，同法制成阴性对照溶液；
取当归对照药材1 g，加水30 mL加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至10 mL同法制成对照药材溶液。吸取上述三种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下检视。结果见图4。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，紫外光下显相同颜色的荧光斑点且阴性无干扰。

1～3.供试品溶液;4.对照药材溶液;5.阴性对照溶液

2.3检查

2.3.1相对密度 照相对密度测定法(《中国药典》2020版四部0601)对3批样品进行测定。结果见表4。

表4 相对密度测定结果(n=3)

2.3.2pH值 照pH值测定法(中国药典2020版四部0631)对3批样品测定。结果见表5。

表5 pH值结果(n=3)

分别对芪珠升白口服液中黄芪、珠子参、当归进行薄层鉴别，黄芪参照文献[7]与2020年版《中国药典》(一部)确定采用正丁醇萃取后氨试液洗涤的方法鉴别黄芪甲苷，所得图谱斑点清晰分离度较好。珠子参与当归处理方法同2020年版《中国药典》(一部)所收录的方法，并对当归展开条件优化为正己烷-乙酸乙酯(2∶1)使比移值适中,斑点清晰。

方中女贞子、珠子参、甘草在方中作为补益药，据报道其均具有免疫调节或升高白细胞的作用[11-13]，根据2020年版《中国药典》对特女贞苷、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、甘草酸铵进行定量分析[14]，分别考察不同流动相甲醇-水，乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水与乙腈-0.1%磷酸水，最终选取乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱后图谱基线平稳，分离度较好。本方为含6味药材的水煎液，成分复杂且极性偏大，分别采用50%甲醇和稀乙醇稀释、正丁醇萃取、大孔树脂洗脱收集的样品处理方法，结果表明直接稀释与液液萃取的方法虽简单，可操作性好但样品杂质过多影响较大，目标成分与杂质峰较难达到有效分离，根据文献[15-20]与目标成分特点选择D101大孔树脂进行提取，经预实验确定以2BV水，3BV 20%乙醇，5BV 60%乙醇2BV·h-1洗脱后收集60%乙醇洗脱液，此时供试品溶液提取充分且无干扰，重复性，稳定性与回收率均良好。本实验建立的薄层鉴别和含量测定方法可用于芪珠升白口服液的质量评价与控制，也可为含有本方药材的复方制剂含量测定提取方法提供参考。