酸化剂对鸡白痢沙门氏菌抑制作用的评价与分析

王晓旭，胡盼，鲍坤，赵成新，李光玉※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；
2.烟台金海药业有限公司，山东 烟台 264010；
3.吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室，吉林 长春 130062）

沙门氏菌是重要的人畜共患病病原菌，目前报道的血清型已超过2 500 个，呈全球性分布。禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属一个或多个成员所引起的急性或慢性传染病，临床上多表现为败血症和肠炎等。鸡白痢沙门氏菌是其中的一员，不同品种、不同日龄的鸡均可感染。在我国，鸡白痢沙门氏菌病是严重危害养禽业的传染病之一[1,2]。近年来研究发现，鸡白痢沙门氏菌引起的感染逐年増加，而且鸡白痢沙门氏菌的耐药性越来越强，这与过量使用抗生素有直接关系，目前已引起各国的广泛关注[3,4]。因此，有效抑制沙门氏菌，寻找抗生素替代品成为各国研究的新方向。各种天然抗菌物质中，有机酸抑菌效果优良、性质稳定及价格低廉在一定范围内使用不易产生耐药性、不影响饲料的适口性等特性，逐渐引起各国学者的广泛关注[5,6]。目前国内外关于酸化剂对鸡白痢沙门氏菌抑菌作用的研究较少，本实验通过不同浓度金立酸对鸡白痢沙门氏菌抑制效果的分析和评价，为生产中鸡白痢沙门氏菌的有效控制提供了新的技术，并为酸化剂作为新型抗生素替代品在抑菌中的应用提供了科学依据。

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株 鸡白痢沙门氏菌购于美国模式菌种收集中心（ATCC）。由于本章中所用菌株均为Salmonella pullorum ATCC10398 株，本章的相关描述中均用沙门氏菌作为简称。

1.1.2 酸化剂 酸化剂由烟台金海药业有限公司研发并生产，商品名为金立酸。

1.1.3 主要仪器设备 恒温培养箱（上海实验仪器总厂）、超低温冰柜（日本，SANYO 公司）、高速冷冻离心机（日本，KUBOTA 公司）、水浴摇床（哈尔滨市东联电子技术有限公司）、可调式恒温水浴箱（美国，HUBER 公司）、接种环、滤膜、试管、试管塞、培养皿、玻璃瓶、L 棒及小滤器等。

1.1.4 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）购自OXOID 公司，其余常规试剂均为国产或进口分析纯产品。蛋鸡产蛋期浓缩饲料购于铁岭辉发农业发展集团饲料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡白痢沙门氏菌接种浓度的选择 参照文献[7]的方法，在TSA 固体培养基上复苏细菌，于37 ℃有氧条件下培养24 h，用平板菌落计数法计算培养基中细菌浓度，并将沙门氏菌接种浓度分别调至105cfu/mL、106cfu/mL 和107cfu/mL。

1.2.2 不同浓度金立酸对沙门氏菌抑制效率的比较

1.2.2.1 金立酸浓度的初步筛选 为了确定金立酸的最佳抑菌浓度，我们调整金立酸终浓度为100‰、10‰、1‰、0.1‰后与105cfu/mL、106cfu/mL 和107cfu/mL的沙门氏菌共同培养24 h，确定初步抑菌浓度之后，再降低稀释比例，进一步确定其抑菌浓度，之后将不同浓度的金立酸与含有沙门氏菌的蒸馏水和饲料共同培养，每组实验重复3 次。

1.2.2.2 金立酸二次浓度筛选和作用时间的确定 根据初步筛选的结果，进一步细化抑菌浓度和时间。金立酸与含有沙门氏菌的蒸馏水或饲料共同培养，分别于1 h、2 h、4 h、8 h 和20 h 取与金立酸相互作用的液体1mL，直接在培养皿上进行涂布，过夜培养，菌落计数，检测沙门氏菌的数量。

蒸馏水处理：试管中加入10 mL 无菌蒸馏水，调整酸化剂和沙门氏菌的终浓度分别为10‰、5‰、3.3‰、2.5‰、2‰和105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL。

饲料处理：试管中加入10 g 饲料，调整酸化剂和沙门氏菌的终浓度分别为10‰、5‰、3.3‰、2.5‰、2‰和105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL，在取样时，加入10 mL 无菌蒸馏水，充分混匀，取1 mL 涂布计数。

2.1 接种细菌浓度的选择

接种的沙门氏菌在培养16 h后达到峰值，并保持至40 h，16~40 h 细菌浓度变化在（2.4~3.0）1012cfu/mL，符合有机酸筛选实验的需要。选择105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL 作为后续实验的接种浓度。

2.2 酸化剂浓度的选择

图1 沙门氏菌的浓度分别是105cfu/mL、106cfu/mL和107cfu/mL，结果表明，培养24 h 后，稀释100‰和10‰ 的金立酸有很好的抑菌效果，培养基澄清；
而稀释1‰和0.1‰的培养基浑浊，其中有大量的细菌。根据初步筛选结果，我们将金立酸细化浓度调整在10‰~1‰之间。

图1 酸化剂稀释不同浓度的抑菌效果Fig.1 The bacteriostatic effect of acidifier with different concentrations

2.3 不同浓度金立酸对沙门氏菌抑制效率的比较

金立酸细化后的终浓度分别是10‰、5‰、3.3‰、2.5‰和2‰，因图片数量较多，文中只列出培养20 h结果，其余见图4。图2 的结果表明，在蒸馏水中添加107cfu/mL 的沙门氏菌、不同添加量的金立酸，培养20 h 时，取1 mL 液体进行细菌平板计数。结果显示，所有稀释倍数均可使沙门氏菌数量降低至不可检测水平。

图2 稀释不同浓度酸化剂的抑菌效果Fig.2 The bacteriostatic effect of acidifier with different concentrations

图4 不同浓度金立酸对沙门氏菌抑制效果的比较Fig.4 The comparison of the inhibitory effect of acidifiers with different concentrations on

图3 的结果表明，将107cfu/mL 的沙门氏菌、蛋鸡浓缩饲料与不同浓度的金立酸充分混合，培养20 h时，按比例用蒸馏水混匀，取1 mL 液体进行细菌平板计数。结果显示，所有稀释倍数均可使沙门氏菌数量降低至不可检测水平。

图3 稀释不同浓度酸化剂的抑菌效果Fig.3 The bacteriostatic effect of acidifier with different concentrations

酸化剂作为安全、绿色的饲料和饮水添加剂在畜禽养殖中被广泛应用，研究报道，不同类型酸化剂抑制或杀灭微生物的效果和机理不同[8-12]。一类只能通过解离出的H+降低胃肠道环境的pH 来达到间接降低病原菌数量的作用，如乳酸苹果酸、柠檬酸及富马酸等大分子有机酸[13-15]；
另一类不但能降低环境中的pH，还对革兰氏阴性菌有抑制作用，如甲酸、乙酸和丙酸等小分子短链有机酸。

乳酸是通过解离H+间接降低病原菌数量的，未解离的乳酸分子以自由扩散方式进入细菌内，细菌胞内为中性至弱碱性环境，pH 大于乳酸的pKa，有乳酸分子在菌体内解离为H+和ROO-，H+离子由于细胞膜的选择透过性不能以自由扩散方式排到菌体外[16]，H+的大量聚集导致菌体内pH 下降，为维持菌体内正常的pH 环境，细菌会消耗ATP 以主动运输的方式将H+泵到菌体外，这一过程需要消耗大量的ATP，从而导致细菌产能效率下降，影响细菌正常生长和繁殖，甚至导致细菌衰竭而死亡。降低消化环境pH 是有机酸在鸡饲料中的作用机制之一，通过降低饲料及消化环境的pH 可刺激消化液分泌，促进鸡消化器官的发育，同时破坏致病菌适宜的生存环境，为益生菌群取得竞争优势并为其生长繁殖创造适宜的酸性环境[17,18]。金立酸中乳酸的含量在10%左右，主要靠解离H+和降低肠道pH达到抑菌作用。郭鹏等[19]研究表明，日粮中添加0.2%复合酸化剂（主要是乳酸）能够显著降低消化道前段pH（P ＜0.05），并能提髙十二指肠蛋白酶和淀粉酶的活性。

甲酸、乙酸和丙酸等小分子短链有机酸具有不同程度的脂溶性，可与细胞膜中脂多糖和磷脂分子等成分结合，破坏细胞膜的稳定性[20]。细菌外膜组分中脂多糖可阻止抗生素和大分子酶类以自由扩散的方式进入胞内，而小分子有机酸可通过外膜蛋白孔道进入周质空间，将磷酸基团和脂多糖羧基质子化，从而减弱外膜各组分间互作，外膜蛋白和脂多糖组分的分解破坏了外膜的完整性，导致内容物外泄，从而实现抑菌功能[21,22]。young 等[23]研究发现不同有机酸在初始pH 和摩尔浓度相同情况下，分子量越小的有机酸对李斯特杆菌抑菌效果越显著。

金立酸的主要成分是乳酸和小分子有机酸，主要成分包含14%甲酸、14%乙酸和2.5%丙酸等。迄今有机酸抑菌作用的分子机制涉及到抑制生物大分子合成、透化细菌外膜、能量竞争、诱导宿主产生抗菌肽和提高胞内渗透压等5 个方面，而且研究的热点主要集中在小分子有机酸方面。本研究将不同浓度的金立酸与不同浓度沙门氏菌共培养，研究发现在蒸馏水中抑菌的效果非常好（主要是模拟生产中以饮水的方式给鸡添加金立酸），不同浓度的金立酸均有很好的抑菌效果，而饲料中添加金立酸，高浓度组（10‰ 和5‰）有很好的抑菌效果，中浓度组（3.3‰和2.5‰）共同作用8 h 开始有抑菌效果，低浓度组（2‰）共同作用20 h 开始有抑菌效果。产生这种结果的原因尚不清楚，可能是饲料中的营养物质为菌株提供营养物质促进它生长繁殖，同时促进细菌形成某种物质增强了其对外界的抵抗力。

总上所述，金立酸对鸡白痢沙门氏菌有很好的抑制效果，饲料中添加金立酸，高浓度酸化剂在共培养1h就起到抑菌效果，随着共培养时间的增加，低浓度酸化剂也起到显著的抑制效果。饮水中添加金立酸，各个浓度在初始时候对沙门氏菌就有良好的抑制效果。