强还原土壤灭菌处理对人参连作土壤细菌群落结构及土壤酶活的影响

闫宁，战宇，苗馨月，王二刚，陈长宝，李琼

（长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春 130117）

人参（Panax ginsengC.A.Mey）为五加科人参属植物[1]，主要分布在中国东北地区、俄罗斯东部和朝鲜地区，因其具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等药理作用[2]，作为名贵的药材从我国古代一直沿用至今。由于人参的药理与保健作用受到广泛关注，其在医药市场上的需求也日益增多。但连作障碍严重制约了人参产业的可持续发展。据报道，土壤微生物群落和多样性失衡、有益微生物减少、病原微生物和各种土传植物病害致病菌富集，以及各种相关因素之间的相互作用进一步加剧人参连作障碍的发生[3-4]，因此，改良土壤是攻克人参连作障碍问题的核心。

土壤微生物属于生态系统中的生产者和分解者，是影响有机质分解、土壤肥力、养分循环和植物养分有效性的关键因素[5-6]，其数量和种类决定着植物的生长发育和健康状况。土壤中最丰富的微生物类群是细菌，它们在土壤有机质和无机质的转化中扮演着重要的角色[7-8]。在非菌落化过程中，它们与植物根际相互作用，释放出营养物质，影响植物生长。除此之外，一些细菌可以通过分泌有益化合物或控制病原菌生长来维持植物健康[9]。细菌的多样性通常受土壤条件、植物季节性和年龄的影响[10]。基于土壤微生物、土壤质量和植物健康之间的相互关系，通过调节土壤微生物群落关系可以有效改善连作障碍问题。

农业管理措施主要包括种植技术管理、水肥管理、病虫害防治3个方面[11]。其中，专业的种植技术可以保障有机农作物品质，适宜的水肥管理可以提高农产品的品质与生产效率，避开病虫害高发期进行作物种植可以保障农作物在生长初期不受病虫侵害。而这些农业管理措施均是通过改变土壤理化性质及土壤微生物活性和组成来影响植物多样性、土壤健康和生产力。据宋时丽等[12]报道，在使用化肥的基础上，复合菌剂可优先降解腐熟的有机物料，释放养分并促进有机质分解酶活性，以此来提高小麦土壤有机质等养分。氯化苦土壤熏蒸法（soil fumigation，SF）具有广泛的生物灭活性，一度被当作缓解人参连作障碍的有效方法，但因其对非目标微生物和土壤生态系统有负面影响，致使人们不断寻求更有效环保的方法[13]。强还原土壤灭菌（reductive soil disinfestation，RSD）是在土壤中加入易分解的有机改良剂（如小麦或米糠等），加水灌溉至饱和后覆盖不透水的塑料薄膜，保持2～4周，可有效杀灭90%以上的病原菌，是一种新型土壤改良方法[14-15]。RSD作用机制与好氧分解过程中积累毒副产物（如有机酸、金属离子、氨、硫化氢和挥发物等）、杀灭好氧病原菌和抑制土壤病原微生物的活性等有关[16-18]。有机基质、土壤温度和厌氧培养时间是保证抑菌效果的主要因素[19-20]。

RSD不仅能够改善土壤酸化和盐渍化问题，对调节土壤微生物群落结构和组成也有积极影响[21]，有望成为改良人参连作土壤的绿色方法。目前，RSD主要应用于番茄[22]、水稻[23]等作物，在人参连作土壤改良上应用较少，因此，本研究设置3种方式对老参地进行改良处理，并通过Illumina Miseq高通量测序技术分析测定3种方式改良后的人参连作土壤细菌群落结构、物种丰度及组成，通过相关性分析土壤细菌群落多样性与土壤酶活性的关系，以期证实强还原土壤灭菌改良人参连作土壤的效果要优于氯化苦熏蒸法。

1.1 研究区概况

试验于2019年7月15日在吉林省吉林市昌邑区左家镇北方药用植物资源圃进行，试验前该地已连续3年种植人参，土壤连作障碍严重。该区属温带季风型大陆气候，天气多变，四季分明。年平均气温5.6℃，年平均降水量679 mm，年平均结冻期5个月以上，无霜期120 d左右，土壤母质类型为暗棕壤。

采用强还原土壤灭菌加土壤熏蒸（RSD+SF）、强还原土壤灭菌加复合菌（RSD+F）以及土壤熏蒸加复合菌（SF+F）3种土壤改良方式对试验地进行处理，其中，采用氯化苦熏蒸土壤，复合菌为有益微生物菌剂，其目的是修复土壤菌群。RSD处理是将动物粪便（鸡粪、牛粪、猪粪=1∶1∶1）与土壤均匀混合，浇水灌溉至100%持水能力，覆盖0.1 mm蓝色塑料薄膜，高温闷棚40 d，土壤温度在30～40℃之间，40 d后揭膜、通风、排水使土壤自然变干；
SF处理是将氯化苦（大连绿峰化学股份有限公司，中国辽宁）注射到距表层15—20 cm的土壤中，覆盖0.1 mm厚蓝色塑料薄膜进行熏蒸消毒，40 d后揭去薄膜，自然晾晒2～3 d后重复翻地3次，保证氯化苦完全挥发。复合微生物菌剂（石家庄沃福沃肥业有限公司）主要包含枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌等。每个处理面积约为30 m2（2 m×15 m），随机排列分布，重复3次。于2019年10月20日移栽大小相近的2年生健康参苗。试验基地田间管理均按当地传统方法进行。

1.2 样品采集

分别于2020年6、7、8、9和10月在试验区采样，每个处理组采用S形取样法随机采集人参5株，抖落根际土壤于自封袋中。样品平行采集3份，共采集9份人参根际土壤样品。收集的样品4℃冷藏保存，用于土壤微生物多样性分析及土壤酶活性检测。

1.3 供试材料

2年生健康人参品种为大马牙，幼苗购自吉林省抚松县万良镇人参交易市场；
动物粪便购自吉林省吉林市昌邑区左家镇居民养殖场，将鸡粪、牛粪、猪粪等量混合后自然发酵；
蓝色塑料薄膜（厚度0.1 mm）购自吉林省鑫丰裕塑料有限公司；
土壤熏蒸用氯化苦（有毒，需使用专用注射器）购自大连绿峰化学股份有限公司；
复合微生物菌剂产自石家庄沃福沃肥业有限公司。

1.4 测定方法

1.4.1 总DNA提取及检测 利用DNA Kit试剂盒(Omega Bio-tek,USA)提取土壤总DNA，利用NanoDrop 2000进行检测DNA浓度和纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.4.2 PCR扩增 用338F(5’-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3’)和806 R(5’-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3’)引物扩增V3～V4可变区，扩增体系20μL：5×FastPfu缓冲液4 uL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2μL，5μmol·L-1引物各0.8μL，FastPfu聚合酶0.4μL；
DNA模板10 ng。扩增程序：95℃预变性3 min；
95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s，27个循环，最后72℃延伸10 min。所用仪器为ABIGeneAmp®-9700型PCR仪。

1.4.3 Illumine Miseq测序 使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit（BIOO SCIENTIFIC，USA）构建Miseq文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台（上海美吉生物医药科技有限公司）进行测序。

1.4.4 土壤酶活性测定 利用相关试剂盒（江苏科特生物科技有限公司）测定土壤漆酶（soil laccase,SL）、土壤过氧化氢酶（soil catalase,SCAT）、土壤酸性磷酸酶（soil acid phosphatase,SACP）、土壤蔗糖酶（soil sucrase,S-SC）、土壤脲酶（soil urease,S-UE）活性。

酶活定义：土壤漆酶活性以37℃条件下每克土壤每分钟氧化1 nmol底物ABTS所需的酶量为1个酶活；
土壤过氧化氢酶活性以37℃每克风干土样每天催化1μmol H2O2降解所需酶量为1个酶活；
土壤酸性磷酸酶活性以37℃中每克土壤每天释放1 nmol酚所需酶量为1个酶活；
土壤蔗糖酶活性以37℃每克土壤产生1 mg还原糖所需酶量为1个酶活；
土壤脲酶活性以37℃每克土壤中产生1 μg NH3-N所需酶量为1个酶活。

1.5 数据处理

采用微生物多样性云分析平台进行数据处理，使用Execl 2013进行图表的制作，采用SPSS 23.0对数据进行显著性分析。

2.1 不同土壤改良方式对土壤细菌群落多样性的影响

从3种方式改良的土壤样品稀释曲线（图1）可以看出，细菌属水平Shannon指数曲线趋向平坦，表明测序数据量足够大，能够反映样品中绝大多数的微生物信息。

图1 样品稀释曲线Fig 1 Sample dilution curve

经3种方式改良后的土壤细菌群落多样性存在显著差异（表1）。从Ace指数与Chao指数中可以看出，RSD+F组处理均显著（P＜0.05）高于其他处理，说明经RSD+F改良处理后的土壤中细菌群落多样性最高，RSD+F组的Shannon指数为4.79，显著（P＜0.05）高于其他组，而且该组的Simpson指数最低，仅为0.01，说明经该组改良后的土壤细菌群落丰度最高，与Shannon指数结果一致。

表1 土壤细菌多样性指数Table 1 Diversity index of soil bacteria

2.2 不同土壤改良模式对土壤细菌群落组成的影响

2.2.1 对土壤细菌群落多样性的影响 土壤微生物群落的组成和多样性是维持植物多样性、土壤健康的必要条件。由Venn图（图2）可知，RSD+SF组共有795个菌属，RSD+F组共有656个菌属，而SF+F组仅有519个菌属，表明经3种方式改良土壤的细菌群落组成具有明显差异。RSD+SF组与RSD+F组的的菌属数量多于SF+F组，说明强还原处理相较于氯化苦熏蒸技术可有效增加细菌属的数量，提高土壤群落的多样性。

图2 土壤细菌属水平Venn图Fig.2 Venn map of soil bacterial community

2.2.2 对土壤细菌门水平的影响 经3种方式改良后，土壤细菌门水平的群落丰度如图3所示，可以看出，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）在3个处理组中丰度均超过35%，厚壁菌门（Firmicutes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）在RSD+SF组和SF+F组的丰度均高于RSD+F组，而RSD+F组的酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度高于RSD+SF组和SF+F组。

图3 土壤细菌门水平群落丰度Fig.3 Soil bacterial phylum horizontal community abundance

2.2.3 对土壤细菌属水平的影响 由图4可知，3种方式改良后，土壤中优势细菌在属水平的种群及丰度均存在着差异。其中经RSD+SF组处理后的土壤前10的优势菌群依次为芽单胞菌属（Gemmat imonas）、芽 孢 杆 菌 属（Bacill us）、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、unclassified_f_Thermomonosporaceae、Mi crob ispor a、uncl ass i fied_f_Gemmati monadaceae、Sphingomonas、norank_f_noranko_Gaiellales、Nitrolancea。经RSD+F组处理后，土壤前10的优势菌群依次为norank_f_noranko_Gaiellales、norank_f_nor ank_o_Vicinamibacterales、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、norank_f_norank_o_Aci dobacter iales、Cand id atus_Udaeobacter、Gaiella、norank_f_norank_o_norank_c_KD4-96、芽孢杆菌属（Bacillus）、类诺卡氏属（Nocardioides）、节杆菌属（Arthrobacter）。而经SF+F组处理后的土壤前10的优势菌群依次为芽孢杆菌属（Bacillus）、norank_f_Gemmatimonadaceae、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Ramlibacter、Roseis olib act e、节杆菌属（Arth robacter）、norank_f_LWQ8、Unclassified_f_Sporolactobacillaceae、小双孢菌属（Microbispora）、类芽孢杆菌属（Paeni bacillus）。

2.3 不同土壤改良方式对土壤酶活性的影响

2.3.1 土壤漆酶活性变化分析 对比不同方式改良后的人参连作土壤在不同月份的漆酶活性（图5）可以发现，3个处理组的漆酶活性均呈先降低后升高的趋势，其中RSD+SF组在8月的漆酶含量最低，仅为53.63 nmol·min-1·g-1；
SF+F组和RSD+F组在7月份的漆酶含量最低，分别为39.03和75.31 nmol·min-1·g-1。这可能与7、8月正处于夏季，土壤温度较高，导致土壤漆酶活性降低有关。韩晓磊等[24]报道，随温度的升高，土壤中的漆酶活性显著降低，与本研究结果一致。

2.3.2 土壤过氧化氢酶活性变化分析 从图6可以看出，RSD+SF组与RSD+F组的过氧化氢酶活性要显著高于SF+F组，其原因可能是人参连作土壤经强还原灭菌处理后比经氯化苦熏蒸处理能增加更多的属水平细菌数量有关，该结果与李冰等[25]报道的土壤过氧化氢酶活性与土壤细菌多样性呈正相关的结果一致。

图6 不同方式改良后人参土壤不同月份的过氧化氢酶活性Fig.6 Catalase activity in different months of Ginseng soil improved by different methods

2.3.3 土壤酸性酸化酶活性变化分析 酸性磷酸酶活性与土壤的pH有关，对比不同方式改良后的人参土壤在不同月份的酸性磷酸酶活性（图7）可以发现，RSD+SF组与RSD+F组的酸性磷酸酶活性显著高于SF+F组，说明经强还原灭菌处理人参连作土壤可能提高土壤的pH。这一结果与王涵等[26]的酸化抑制碱化激活酸性磷酸酶活性结论一致。

2.3.4 土壤蔗糖酶活性变化分析 从图8可以看出，除了6月和10月，其他月份的蔗糖酶活性高低顺序为RSD+SF组＞RSD+F组＞SF+F组，因为蔗糖酶的活性能够表征土壤的肥力水平[27]，因此这一结果表明经强还原土壤灭菌处理后的连作土壤肥力要强于氯化苦熏蒸处理。

图8 不同方式改良后的人参土壤不同月份的蔗糖酶活性Fig.8 Sucrase activity in different months of Ginseng soil improved by different methods

2.3.5 土壤脲酶活性变化分析 从图9可以看出，3个处理组RSD+SF组的脲酶活性均呈先升高后降低的趋势，其中在8月时的脲酶活性均最高，具体表现为RSD+F组＞RSD+SF组＞SF+F组，脲酶活性依次为6 451.12、4 978.66、3 218.60 U·g-1，因为脲酶是土壤中氮转化的重要酶类之一[28]，该结果表明经强还原灭菌处理后的连作土壤中的氮含量要高于经氯化苦熏蒸处理后的连作土壤中的氮含量。

图9 不同方式改良后的人参土壤在不同月份的脲酶活性比较Fig.9 Urease activity in different months of Ginseng soil improved by different methods

2.4 土壤细菌群落多样性与土壤酶活性相关关系分析

图10为经3种方式改良后的土壤不同细菌群落结构与土壤酶活性的相关关系。可以看出，在总丰度前30的属细菌中，不同细菌群落结构与土壤酶活性存在差异，其中土壤漆酶与Candidatus_Solibacter呈显著正相关关系（P＜0.05）；
土壤过氧化氢酶与Ph enylob act erium呈显著负相关关系（P＜0.05）；
土壤酸性磷酸酶与多种菌属呈正相关关系，其中与norank_f_nor ank_o_norank_c_K D4-96和norank_f_nor ank_o_Gai el lales呈 显 著 正 相 关 关系（P＜0.05），与Cand id atus_Udaeobacter呈极显著正相关关系（P＜0.01）；
土壤蔗糖酶与Roseisolib acter呈显著负相关关系（P＜0.05），与其他菌属的相关系数均较低；
土壤脲酶影响着多种菌属，其中与norank_f_nor ank_o_Vicinamibacter al es呈显著正相关关系（P＜0.05），与unclass ified_f_Gemmat i monadaceae呈显著负相关关系（P＜0.05），与Paenibacill us（类芽孢杆菌属）、unclass ified_f_S porolactobacillaceae以及Raml ibacte均呈极显著负相关关系（P＜0.01）。

图10 土壤细菌群落与土壤酶活性相关性Fig.10 Correlation between soil bacterial community and soil enzyme activity

研究表明，随着人参栽培年限增加，人参根际土壤中的有害真菌属的数量会增多，而有益细菌属的数量会减少[29]，因此可以通过增加有益细菌属的数量及丰度来缓解人参连作障碍问题。本研究通过分析3种方式改良后的人参连作土壤中的有益细菌属数量及丰度发现，RSD+SF组和RSD+F组的有益细菌属数量均高于SF+F组，细菌群落丰度也不同，原因可能与人参连作土壤经强还原土壤灭菌处理后，因输入较多的有机物而具有较高的碳固存潜力，并有效抑制土壤中的病原真菌微生物，从而使土壤中有益微生物占领有利生态位有关，这与Ali等[30]的研究结果一致。除此之外，经3种方式处理后的人参连作土壤中各自存在着不同的优势菌群，其中Baci l lus（芽孢杆菌属）为3种改良土壤中共有的优势菌群，该菌属在SF+F组中所占的丰富度最高，高达9.16%，而在RSD+F组所占的丰富度最低，仅为1.82%。Bacillus具有巨大的遗传多样性和代谢多样性，在土壤生态系统中发挥着从养分循环到植物抗逆性等多种生态作用，被认为是有效拮抗病原菌生长的有益菌属[31]。而芽孢杆菌属的成员具有多种有益的特性，通过获取营养、产生植物激素来全面改善生长、保护植物免受病原体和其他非生物胁迫，直接或间接地帮助植物生长[32]。其中，芽孢杆菌通过参与促进植物生长的各种直接和间接机制，包括增溶和矿化氮、磷和其他营养物质以及产生植物激素、铁载体、抗菌化合物和水解酶[33]，从而具有诱导系统抗性（induced systems resistance，ISR）和对非生物胁迫的耐受性[34-35]。Norank_f_norank_o_Vi ci namib acterales、S phingomonas、norank_f_nor ank o_Gaiellales为RSD+SF组与RSD+F组的共有优势菌群，推测这可能与强还原土壤灭菌处理增加这3种有益细菌属的数量有关。

土壤酶参与土壤生态系统中的碳、氮、硫和其他养分的循环，其活性大小能够反映某种土壤状况下生物化学过程的相对强度，因此测定相应酶的活性，可以间接了解某种物质在土壤中的转化情况[36]。土壤漆酶是由氮消耗引起的重要酚氧化酶，可通过降解底物来保护环境[37-38]。改土后的土壤漆酶与Cand id atus_Soli bacter呈显著正相关关系（P＜0.05），其中RSD+F组的土壤漆酶活性显著高于其他处理，这可能是由于强烈的土壤强还原环境可加速腐殖质的分解，从而提高土壤漆酶活性[39-40]。土壤过氧化氢酶广泛存在于土壤中，其活性与土壤有机质含量和微生物数量有关。RSD+SF与RSD+F组的土壤过氧化氢酶活性先呈上升的趋势，这可能与强还原灭菌处理中的有机物料可转化生成土壤有机质，而有机质的数量与过氧化氢酶的活性呈正相关有关[41]。研究表明，土壤酸性磷酸酶可参与植物体内的有机磷的分解及再利用过程[42]。改土后的土壤酸性磷酸酶与nor ank_f_nor ank_o_nor ank_c_KD4_96、norank_f_norank_o_Gaiellales以及Candidatus_Udaeobacter呈显著正相关关系（P＜0.05），RSD+SF组和RSD+F组的土壤酸性磷酸酶活性显著高于SF+F组，猜测与强还原灭菌处理使Cand id at us_Ud aeob act er等菌群数量增加，导致有效磷被大量富集，使人参被迫提高根系酸性磷酸酶基因表达，从而增加土壤酸性磷酸酶活性有关[43]。土壤蔗糖酶可直接参与有机质的代谢过程，不仅能够表征土壤生物学活性强度，也可作为土壤熟化程度和土壤肥力水平的指标[44]。改土后的土壤蔗糖酶与玫瑰杆菌属（Roseisolibacter）呈显著负相关关系（P＜0.05），Ros ei sol ibacter仅为SF+F组的优势细菌属，其丰度高达3.82%（表2），这与SF+F组的蔗糖酶活性要显著低于其他组的结果一致。土壤脲酶能促进尿素的水解，酶促产物氨是植物可用的氮源之一，其活性可以反映土壤供氮的能力[45]。改土后的土壤脲酶与norank_f_norank_o_Vi ci namibacterales呈显著正相关关系（P＜0.05），经3种方式改良处理后的脲酶活性均先呈上升趋势，以RSD+F组的脲酶活性上升趋势最为明显，这可能与强还原土壤灭菌处理可有效增强土壤的供氮能力从而改善人参连作土壤的营养状况有关[46]。

强还原土壤灭菌已被证实是控制许多土传病原体和疾病的有效且环保的方法。在本研究中，3种土壤改良方式在不同程度上均增加人参连作土壤的有益细菌属的数量及丰富度，并提高了土壤酶活性，其中RSD+SF及RSD+F组的有益细菌属的数量、丰富度及土壤酶活性要高于SF+F组，可能与强还原土壤灭菌技术相较于氯化苦熏蒸处理更适合微生物的生长与繁殖，并增加土壤的群落丰度，厌氧微生物形成优势菌群后，增强根系分泌物对特定的细菌种群的选择性，促进了植物对营养物质的吸收，从而提高土壤酶活性有关[47]。该结果初步证实强还原土壤灭菌缓解人参连作障碍的效果要优于氯化苦熏蒸法。