光肩星天牛核糖体蛋白基因AgRpS8功能及表达特征分析*

马晓乾 高 宇 孙 妍 尚尔雨

（黑龙江省林业科学院森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150081）

细胞内核糖体在mRNA 和tRNA 的协同作用下，形成核糖体大小亚基蛋白，真核生物核糖体的两个亚基分别为60S 和40S，几十种核糖体蛋白和几种rRNA 构成一个核糖体[1,2]。研究表明，昆虫体内的核糖体蛋白功能除参与蛋白质的合成外，还参与细胞增殖与分化、生长发育及调控等生理过程。如核糖体蛋白基因GdRpS3 在沙葱萤叶甲不同发育阶段的表达与其生长发育阶段及环境温度有关，在其成虫滞育过程中起着重要作用[3]。有研究发现，小鼠在缺乏营养的条件下，生物体表现出抑制rRNA 的合成，进而打破核糖体蛋白与核糖体RNA之间的平衡关系，而此时多余的核糖体蛋白L5和L11 与泛素蛋白连接酶E3（E3UbiquitinLigases）样蛋白MDM2 结合，加速了脂肪细胞的脂解过程，使线粒体内脂肪酸β 氧化增强，对抗生物体缺乏营养的不利环境[4,5]。而在这一过程中，RpS3、RpS15、RpL5和RpL11 等不同类型的核糖体蛋白发挥调节细胞增殖和营养循环的作用[6]。

糖体核糖体蛋白RpS8 是一类周期素依赖性激酶11（Cyclin-dependent kinases,CDK11）p46 相互作用蛋白，CDK11 蛋白家族以丝氨酸（Serine，Ser）或苏氨酸（Threonine,Thr）蛋白激酶的形式在生物体内参与细胞周期和细胞分化的调控[7]。有研究发现核糖体蛋白基因NlRpS8 在褐飞虱生长和繁殖中发挥着重要的作用[3]。光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）是一种世界性害虫，以幼虫在树木主干和主枝中蛀坑取食形成危害，分布广泛，危害杨、柳、榆、槭等十几种树种，造成严重的经济损失[8-11]。解析核糖体蛋白在光肩星天牛生长发育过程中的功能作用，有助于探索控制光肩星天牛新的方法或途径，而有关核糖体蛋白RpS8 在光肩星天牛功能特征还不明确。本研究在分析光肩星天牛AgRpS8序列结构及克隆该基因的基础上，采用生物信息学方法预测其功能，采用实时荧光定量PCR 方法解析了该基因的时空表达情况，为进一步明确AglaRpS8 功能特征及在光肩星天牛生长发育过程中的作用机制奠定基础，以期为光肩星天牛利用靶标基因防治提供新的思路和途径。

1.1 供试昆虫

光肩星天牛采集于哈尔滨市哈平路行道绿化树的糖槭。幼虫和蛹于4～6 月、9～11 月通过解剖被害木段收集；
成虫于7 月上旬至8 月下旬通过人工捕捉收集，在实验室内将雌雄成虫分开，经液氮处理后，放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂

Taq PCR Master 试剂盒、RNA Extraction Kit 提取试剂盒、Taq MasterMix DNA 聚合酶、PrimeScript RT reagent Kit、RNA 酶抑制剂均购于Takara。Prime Script RT reagent Kit、CDSⅢ/3′PCR primer 试剂盒，GenEluteTM回收凝胶试剂盒、Plasmid Extraction Mini Kit 质粒提取试剂盒等为Sigma 公司产品。克隆载体pMD18T、DH5a 感受态细胞由Tiangen 生化提供。

1.3 序列分析

光肩星天牛核糖体蛋白基因AgRpS8（Accession：XP_023310889）CDS 序列从Genbank 中查询获得。基因克隆及荧光定量实验所用引物利用Primer Premire 5.0 软件进行引物设计（表1），由上海美吉生物公司完成。AgRpS8 基因的同源性采用NCBI中的BlastX 和MAFFT 进行序列比对分析；
AgRpS8蛋白的分子质量、等电点等理化性质利用在线软件ExPASy 进行分析；
AgRpS8 蛋白是否具有信号肽用SignalP V4.1 程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行预测，是否具有跨膜区结构通过TMHMM2.0 预测。与其他昆虫的核糖体蛋白系统发育树采用MEAG7 软件进行构建并分析。

表1 AgRpS8 基因克隆及荧光定量所用引物

1.4 总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成

各取雌雄光肩星天牛成虫1 头，于研钵中浸入液氮研磨，利用RNA Extraction Kit 试剂盒提取总RNA，并利用PrimeScript RT reagent Kit 和CDSⅢ/3′PCR primer 反转录，37℃下培养1 h，生成cDNA 第一链。合成后置于-20 ℃冰箱内保存，以待后续实验所用。

1.5 qRT-PCR 测定AgRpS8 的时空表达分析

收集雌雄光肩星天牛1～2 龄、3～4 龄幼虫、5 龄幼虫、雄成虫、初羽未交尾雌成虫、交尾后怀卵雌成虫，提取各虫态或龄期RNA。根据CDS 序列设计引物和内参基因见表1。使用50 μL PCR 体系反应，在90 ℃下持续35 s，随后以95 ℃持续10 s，以65 ℃持续30 s，60～90 ℃以0.5 ℃递增5 s 的40 个循环生成熔解曲线。每个反应进行3次重复，基因表达量利用2-ΔΔCt方法计算[12]。使用统计学软件SPSS19.0 分析基因在各样品中相对表达水平,利用单因素方差（AVOVA）进行多重比较分析基因相对表达量的差异显著性水平（P＜0.05）。

2.1 AgRpS8 基因序列分析

AgRpS8 基因开放阅读框ORF 区长度627 pb,编码208 个氨基酸，无跨膜螺旋区，N 端没有信号肽，该蛋白属于无跨膜螺旋及信号肽结构蛋白（图1）。经在线软件ExPASy 预测，AgRpS8 基因等电点（Pl）为5.21，分子量（Mw）为49.992KDa。经Hphob方法分析，AgRpS8 基因序列中，疏水性第121 位氨基酸为Hydropathy Score 最高值3.87，第21 位氨基酸为Hydropathy Score 最小值-4.07（图2）。

图1 AgRpS8 基因DNA 序列及编码蛋白的氨基酸序列

图2 AgRpS8 疏水性分析

AgRpS8 基因保守结构域预测为PTZ00148 超级家族40S 核糖体蛋白S8（40S ribosomalprotein S8），其中长度1-618pb 与其一致，E-value 值1.18e-115（图3）。从AgRpS8 中发现了6 个p-value 值较高的Motif 结构，为核糖体蛋白家族中常见的保守的结构特点（图4）。通过BlastP 同源性及序列比对结果表明，与AgRpS8 同源性排列前三的核糖体蛋白基因依次为：意大利蜜蜂（Apis mellifera）AmRpS8 基因，同源性为87.02%；
草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）SfRpS8 基因，同源性为83.65%；
果蝇（Drosophila melanogaster）DmRpS8 基因，同源性为78.37%（图4）。

图3 AgRpS8 保守结构域预测

图4 AgRpS8 基因motif 结构分析

图5 AgRpS8 基因与果蝇、意大利蜜蜂、草地贪夜蛾Rps8 序列比对

进一步与其他昆虫核糖体蛋白RpS8 建立系统发育树（图6），分析表明，光肩星天牛AgRpS8与赤拟谷盗的2 个核糖体蛋白（TcRpS8-like、TcRpS8）聚集在同一个分支上，表明光肩星天牛AgRpS8 核糖体蛋白与赤拟谷盗的2 个核糖体蛋白可能具有类似的功能，亲缘性接近。

图6 AgRpS8 与其它昆虫RpS8 的系统发育树

2.2 AgRpS8 基因的时空表达特征

通过pMD18-T 载体设计AgRpS8 基因的引物，选取引物酶切点XbaI 和XmaI（图7），结果显示，核糖体蛋白基因AgRpS8 的相对表达量在光肩星天牛不同发育阶段均有一定量的表达，在幼虫1～2 龄期，3～4 龄期，5 龄期相对表达量较平稳；
而在光肩星天牛成虫期相对表达量较低；
但在光肩星天牛雌虫交配后怀卵的发育阶段相对表达量达到最高值2.46，显著高于其他发育阶段（P＜0.05）（图8）。

图7 pMD18-T 载体酶切点

图8 AgRpS8 基因在光肩星天牛不同发育阶段相对表达量

昆虫体内的核糖体对于维持其正常的生命活动和调控昆虫的生长发育起着关键作用[13-15]。CDK11 家族蛋白在细胞增殖和分化过程中发挥有重要的作用，RpS8 作为一类核糖体亚基蛋白，参与调控分泌及代谢途径[3-5]。本研究解析了光肩星天牛核糖体蛋白AglaRpS8 基因序列结构，理化性质和功能特征，在基础上通过基因保守结构域及系统发育分析，AglaRpS8 基因与鞘翅目赤拟谷盗核糖体蛋白TcRpS8 和TcRpS8-like 在结构与功能上可能存在相似的作用。

核糖体蛋白AgRpS8 在光肩星天牛不同发育阶段均有不同程度的表达，在幼虫1～5 龄期表达量较高，在雄性光肩星天牛成虫和雌性未交配的光肩星天牛成虫中表达量降低，而在交配后怀卵的雌性光肩星天牛成虫中表达量达到最高值。这一结果表明，核糖体蛋白AgRpS8 基因可能参与光肩星天牛雌虫孕育过程中细胞的增殖和蛋白质合成。本研究初步解析了核糖体蛋白基因AgRpS8 在光肩星天牛不同发育阶段的表达规律，对可能发挥的功能进行了预测，但未进行验证，是否发挥有其他生理功能作用也尚不明确，因此，有待进一步开展AgRpS8 基因的生理机制及相关代谢通路的研究。