NFKBIZ基因在乳腺癌中的生物学功能及临床诊断价值研究*

吴军营 王凌霞 吴茜茜 朱志宸 王波 杨欢

近日，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示：女性乳腺癌发病人数首次超过肺癌，成为全球最常见的癌症。全球有超过226万女性患有乳腺癌，约占所有新确诊癌症人数的11.7%，占女性新确诊癌症人数的24.5%，居女性癌症发病人数的首位[1]。早诊早治是减轻乳腺癌危害的最好办法之一，早期乳腺癌患者的5年生存率可达95%。而传统的肿瘤标志物如CA153和CEA等在乳腺癌的筛查及诊断方面缺乏特异性，因此寻找特异的分子标志物也将为乳腺癌的筛查、早期诊断及复发监测提供可靠的支持，对乳腺癌的诊治具有重要的科学意义和临床价值。

IκBζ蛋白由NFKBIZ基因编码，是细胞核IκB蛋白家族的第三个成员，最早于2000年被KITAMURA等人在LPS刺激的巨噬细胞核内发现[2]。有研究显示，IκBζ与炎症及肿瘤密切相关。在病原体引起的炎症反应中，IκBζ可促进巨噬细胞分泌促炎因子IL-6、IL-12和CCL2及抑炎因子IL-10[3]。在肺炎球菌肺部感染中，IκBζ通过促进单核细胞分泌IL-6及GM-CSF发挥免疫调节作用[4]。在肿瘤中IκBζ具有抑癌和促癌的双重作用。IκBζ在活化B细胞（ABC）弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者表达水平显著升高，IκBζ表达下调后细胞死亡，在ABC和DLBCL中发挥促癌作用[5]。IκBζ在脑胶质瘤中高表达，IκBζ水平越高，IL-6、IL-8和CXCL1表达越高，患者生存时间越短，具有促癌作用[6]。但是，也有研究报道IκBζ过表达可下调STAT3转录活性，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[7]。到目前为止，IκBζ在乳腺癌中的表达及生物学作用尚不明确。本文以乳腺癌为研究对象，探讨NFKBIZ基因在乳腺癌发展过程中的作用并结合临床资料分析其临床诊断价值。

1 材料

1.1 临床资料：选取2017年8月～2018年4月，苏州大学附属第二医院普外科收治的19例乳腺癌患者的癌组织以及癌旁组织，并收集相应病理资料。所有病例均满足以下条件：①组织标本病理切片经过病理科的鉴定，确定为对应的癌组织或癌旁组织；
②患者未进行其他的抗肿瘤治疗；
③患者未患有会影响NFKBIZ基因表达的其他疾病。该研究经过苏州大学附属第二医院伦理委员会批准（批件号：JD-LK-2021-115-01）。

1.2 细胞及试剂：人乳腺癌细胞系（MCF-7、MDAMB-231细胞）（中国科学院细胞库）；
胎牛血清、DMEM高糖培养基（Gibco公司）；
Trizol试剂（Sigma公司）；
反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（Vazyme公司）；
siRNA干扰序列（苏州吉玛基因股份有限公司）；
Lipofectamine 2000 Reagents（Invitrogen公司）；
Transwell 小室（Corning公司）；
RIPA、PMSF、0.25%胰酶（碧云天生物技术有限公司）；
GAPDH、IκBζ抗体（Abcam公司）。

2 方法

2.1 细胞的培养及转染：乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）用含有10%胎牛血清、加入青链霉素双抗的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。采用siR-NFKBIZ干扰序列（序列见表1）转染MCF-7乳腺癌细胞系，转染6 h后更换培养液，48 h后收集细胞，提取细胞RNA，逆转录成cDNA，采用qPCR检测NFKBIZ基因表达水平，判断敲减效率，同时转染48 h后的细胞进行胰酶消化用于后续实验。

表1 siRNA序列

2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）：参照试剂说明书，使用Trizol试剂提取组织及细胞总RNA，反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，在QuantStudio 3 system进行实时荧光定量PCR测定。所有实验重复3次，并采用2-ΔΔCt方法分析NFKBIZ基因相对表达水平。选择GAPDH作为内参。引物序列见表2。

表2 引物序列

2.3 蛋白质免疫印迹（western blot，WB）：参照试剂使用说明书，使用RIPA裂解液提取乳腺癌及良性乳腺病组织总蛋白，加入5×的loading buffer煮沸5 min，置冰上冷却。通过10%的SDS-PAGE分离目标蛋白质，300 mA 90 min进行转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，切割条带，加入一抗4℃孵育过夜（GAPDH和IκBζ抗体稀释比例为1∶1000）。TBST清洗3遍，每遍10 min；
然后，将膜与二抗（1∶5000）在37 ℃孵育1 h，GAPDH作为内参对照。使用Image J软件分析目标条带。

2.4 平板克隆实验：将siRNA转染48 h的MCF-7细胞（1×103个/孔）接种于6孔板中。恒温培养箱中培养10 d后，移除培养基，4%多聚甲醛固定20 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗1次，用0.1%结晶紫染色15 min，PBS清洗3次，晾干后拍照，使用Image J软件进行克隆细胞团计数。克隆形成率（%）＝（克隆团数／接种细胞总数）×100%。

2.5 Transwell迁移实验：使用Transwell小室迁移实验检测siRNA转染乳腺癌细胞后对细胞迁移能力的影响。将转染48 h后的MCF-7细胞，用DMEM无血清培养基重悬，调整细胞浓度为5×105个/mL，在Transwell小室上层加入200 μL细胞悬液（即1×105个/孔），在小室下层中加入600 μL含有10%FBS的DMEM培养基，然后置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后取出，弃去小室上层中的培养液，用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，医用棉签轻柔擦拭小室上层内侧未迁移的细胞，PBS洗涤3遍，室温下自然干燥后用倒置显微镜拍摄记录，每孔至少选择三个视野，并使用Image J软件计数后取平均值，结果采用±SD形式表示。

3 统计学分析 采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析。符合正态分布数据采用t检验（student"s T test）评估组间的差异，非正态分布非配对数据采用曼-惠特尼秩和检验（Mann-Whitney U test），非正态分布配对数据则采用威尔科克森符号秩和检验（Wilcoxon test），P＜0.05表示差异具有统计学意义。

1NFKBIZ基因在乳腺癌细胞系及组织中显著上调 qPCR的结果显示（图1），NFKBIZ基因在三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231的表达水平显著高于恶性程度较低的MCF-7细胞（P=0.0004）；
在19对乳腺癌及癌旁组织中，癌组织内NFKBIZ的表达水平显著高于癌旁组织（P=0.0046），差异具有统计学意义。

图1 NFKBIZ在乳腺癌细胞系及组织中的表达水平

图2 IκBζ在乳腺癌组织及良性乳腺病组织中的表达

2NFKBIZ基因编码蛋白IκBζ在乳腺癌组织中高表达 免疫组化及WB检测结果显示，乳腺癌组织中IκBζ的表达水平明显高于良性乳腺病组织。

3 siRNA敲减效率验证 采用siRNA转染MCF-7细胞后进行qPCR检测，验证siR-NFKBIZ的敲减效率，结果显示敲减后NFKBIZ基因的表达量降低50%左右（P=0.0004，见图3），具有统计学意义，可进行后续实验。

图3 siRNA敲低效率验证

4NFKBIZ基因敲减后抑制MCF-7细胞的增殖 平板克隆实验结果显示，siR-NFKBIZ干扰序列转染乳腺癌细胞MCF-7后， MCF-7细胞的增殖能力明显减弱（图4）。

图4 NFKBIZ基因敲减前后MCF-7细胞增殖能力比较

5NFKBIZ基因敲减后抑制MCF-7细胞的迁移 Transwell小室迁移实验结果显示，siR-NFKBIZ转染乳腺癌细胞MCF-7后，其迁移能力明显减弱（图5）。

图5 NFKBIZ基因敲减前后MCF-7细胞的迁移能力比较

6 乳腺癌组织NFKBIZ基因诊断乳腺癌的ROC曲线GraphPad Prism8统计制图软件显示曲线下面积为0.810，cutoff值为1.418，敏感性为81.8%，特异性为90.9%（图6）。

图6 NFKBIZ基因诊断乳腺癌的ROC曲线

7 癌组织内NFKBIZ基因表达水平与临床病理参数的关系 结合19对乳腺癌组织与其配对的癌旁组织NFKBIZ基因的表达差异倍数（Fold change）与病理资料进行分析，结果如下：NFKBIZ基因在乳腺癌组织中的表达水平与患者的年龄、肿瘤大小显著相关（P＜0.05），而与淋巴结转移、TNM分期等无显著相关性（P＞0.05）（表3）。

表3 NFKBIZ基因表达水平与乳腺癌患者临床病理参数的关系

在IκBζ蛋白及其编码基因NFKBIZ被发现后，其与疾病发生发展的研究被相继报道。IκBζ对NF-κB的活性有抑制作用[8]，并能通过调控CCL2、IL-10等炎症相关因子来抑制炎症的发生[3，9]。但IκBζ也能够加重一些自身免疫性疾病的发展，例如银屑病[10]、干燥综合征[11]、克罗恩病[12]、类风湿性关节炎[13]等。同样IκBζ以及编码基因NFKBIZ具有促癌和抑癌的双重作用，例如IκBζ在活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤患者体内表达水平显著升高，在该肿瘤中发挥促癌作用[5]，而有研究表明IκBζ的过表达可使STAT3转录活性下调，抑制细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，从而发挥抑癌作用[7]。到目前为止，IκBζ在乳腺癌中的表达及生物学作用尚不明确。因此我们通过在mRNA水平敲低NFKBIZ来研究其在乳腺癌中的生物学功能，以及通过乳腺癌组织中的表达差异结合临床病理资料，探索其作为生物标志物的潜在价值，为临床的诊断提供可靠依据。

本实验结果显示，NFKBIZ基因在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达水平明显高于MCF-7，其低表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。在乳腺癌患者中，癌组织内的NFKBIZ基因表达水平明显上调，其差异有统计学意义，western blot检测结果也显示其编码蛋白在癌组织中显著上调，说明NFKBIZ基因及其编码蛋白可能发挥促癌作用。ROC曲线结果显示，利用NFKBIZ基因的相对表达量cutoff值（1.418）来诊断乳腺癌的敏感度为81.8%，特异度为90.9%，提示其具有一定的诊断效能。因整个实验过程时间较短，未能进行长期连续的回访，故未进行相应的预后分析，无法判断NFKBIZ基因的表达与预后的相关性。在与病理参数相关性的分析中，发现NFKBIZ基因与肿瘤大小、病患年龄显著相关，而与病理类型、淋巴结转移、TNM分期无显著相关性。NFKBIZ基因与患者年龄显著相关，其可能原因包括：①随着女性年龄的增大，体内的激素水平呈现递减趋势，而乳腺癌的患病率和患者体内的激素水平存在相关性[14-15]，也许NFKBIZ基因的表达水平和激素也存在关联，从而导致患者乳腺癌的发生和发展；
②该分析得出的显著性的差异可能是样本量不足导致的，需要通过扩充样本量进一步确认NFKBIZ基因与患者年龄的相关性。

综上所述，本研究发现NFKBIZ基因在乳腺癌患者的癌组织中表达较癌旁组织显著升高，体外功能实验显示其在乳腺癌发展过程中发挥了促癌作用，并且可能成为乳腺癌诊断的新指标。但由于收集乳腺癌组织标本例数较少，与临床病理参数的相关性有待进一步确认。在以后的研究中，应扩大样本量来进行检测以进一步验证其在乳腺癌中的诊断价值，并通过与外泌体等新兴领域结合，探索其作为乳腺癌治疗新靶标的临床意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突