Streptomyces,albovinaceus,DSM,40136中环二肽的盐胁迫发掘

吴贵贵,韩 萍,钟素珍,谢运昌*,朱 笃,2*

(1.江西师范大学生命科学学院,江西 南昌 330022;2.江西科技师范大学生命科学学院,江西省生物加工过程重点实验室,江西 南昌 330038)

放线菌可生产大量种类丰富、结构新颖且活性优良的次级代谢产物,是临床药物开发的重要资源[1].通过发掘放线菌所蕴含的次级代谢产物来开发新药物,这是治疗当前极端耐药、抗药性疾病的有效手段之一[2-3].目前,随着放线菌研究的深入,一种新型的菌株次级代谢产物发掘策略——OSMAC(one strain many compounds)——应运而生,该策略的核心思想是通过改变菌株的培养条件与培养体系的各种参数来激活单一菌株生产多种次级代谢产物[4-6].通过提升培养基的盐离子浓度开发菌株次级代谢潜能是OSMAC策略最为简便易行的方法之一,该方法已成功运用于放线菌次级代谢产物发掘领域中[7].

环二肽是由2个氨基酸分子通过形成肽键缩合而成的最小环肽,也被称为二酮哌嗪类化合物[8-9].环二肽的命名由每个氨基酸的3个字母缩写加上绝对构型前缀组成(如Cyclo(L/D-Xaa-L/D-Yaa)).环二肽含有稳定的六元环结构和刚性空间构象,具有广泛的生物学活性,是目前临床药用先导化合物开发的热点[10].放线菌蕴含丰富的环二肽类次级代谢产物,是重要的活性环二肽发掘对象[11].在放线菌中,环二肽的生物合成途径主要有2大类:一类是通过非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)合成环二肽;另一类是通过特异性的环二肽合酶(cyclodipeptide synthase,CDPS)以氨酰-tRNA为底物合成环二肽[12-13].这2类环二肽合成催化酶的编码基因也可以作为分子标记,在放线菌菌株基因组信息的指导下,结合盐胁迫等OSMAC策略,可针对性地开发放线菌环二肽活性分子.

StreptomycesalbovinaceusDSM 40136(=NRRL B-2566)是1株来源于陆生土壤的放线菌，也称为S.globisporusDSM 40136[14].该菌株已完成了全基因组测序分析(NCBI Accession:NZ_MUAX00000000.1).基于生物信息学软件,对该菌株的次级代谢潜能分析发现:该菌株具有大量的肽类次级代谢生物合成基因(簇),可用于发掘以环二肽为代表的多种肽类次级代谢产物.本文以该菌株为研究对象,选择常规放线菌培养基,通过添加海盐对菌株进行胁迫培养,成功地利用含海盐质量分数为3%的M-ISP4培养基激活菌株生产出具有抗肿瘤、免疫及代谢调控活性的环二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu)[15].该环二肽的成功合成,不仅有效拓展了放线菌环二肽的开发途径和菌株资源库,而且为放线菌次级代谢产物的发掘提供了良好的借鉴与参考,有利于促进放线菌源次级代谢产物的综合开发与利用.

1.1 菌株与培养方法

S.albovinaceusDSM 40136购自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ).该菌株使用M-ISP4(可溶性淀粉1%,细菌学蛋白胨0.1%,酵母提取粉0.05%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.1%,(NH4)2SO40.2%,NaCl 0.1%,CaCO30.2%,pH值为7.2～7.4,固体培养基加入琼脂粉1.5%～2.0%)平板在28～30 ℃下进行传代培养.培养基配置所需试剂均购自国药集团.

1.2 菌株次级代谢产物生物合成基因(簇)分析

S.albovinaceusDSM 40136菌株的基因组测序数据自NCBI(Accession:NZ_MUAX00000000.1)下载.然后将编辑成FASTA格式的菌株基因组数据上传至antiSMASH(https://antismash.secondarymetabolites.org),分析菌株含有的次级代谢产物生物合成基因簇的分布信息和产物结构预测数据.再依据比较分析结果游离相应的基因簇序列,进一步利用2ndfind软件(http://biosyn.nih.go.jp/2ndfind/)和Blast软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对游离得到的基因(簇)进行校对修订,最终获取菌株次级代谢产物生物合成基因簇的分布排列信息.

1.3 菌株发酵培养及代谢产物的分离纯化

菌株的代谢产物分析培养采用250 mL三角瓶进行,往瓶内加入50 mL M-ISP4液体培养基,然后添加含海盐质量分数为3%的M-ISP4液体培养基.在上述2种培养基中分别接入约1 cm2平板培养的菌体,在28～30 ℃、转速为200 rpm的条件下培养7 d.然后发酵菌液用100 mL乙酸乙酯进行萃取,萃取物用旋转蒸发仪器处理后溶解于2 mL甲醇中,并取样20 μL进行HPLC分析.

针对环二肽产物的分离纯化,本文采用2级发酵体系.其中第1级发酵为种子发酵,将菌株接种于50 mL添加含海盐质量分数为3%的M-ISP4液体培养基的250 mL三角瓶中，在28～30 ℃、转速200 rpm的条件下培养2 d;然后将50 mL种子菌液转接于200 mL添加含海盐质量分数为3%的M-ISP4液体培养基的1 L三角瓶中，继续在28～30 ℃、转速为200 rpm的条件下培养6 d.最后,将菌体与发酵液上清分离,用乙酸乙酯萃取发酵上清液中的产物,并用旋转蒸发仪器处理成萃取浸膏.

将萃取浸膏混合在正向硅胶中进行处理，首先进行正向柱层析，洗脱流动相为V(MeOH)∶V(CH2Cl2)=0∶100、2∶98、4∶96、6∶94、8∶92、1∶9、2∶8、5∶5.然后将含有环二肽产物的流分(V(MeOH)∶V(CH2Cl2)=2∶98)进行分子筛柱层析,并收集含有环二肽的层析流分,进行后续制备HPLC分离,最后将获得的化合物纯品溶解于DMSO-d6中进行1H/13C-NMR鉴定,确定为Cyclo(L-Pro-L-Leu)分子.

1.4 菌株发酵产物及分离纯化产物的HPLC分析方法

HPLC分析使用的仪器为Agilent 1260 Infinity System,使用的分析柱为Prodigy ODS-2 C-18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm).检测使用的流动相有:A相为15%的乙腈水溶液,含0.1%的乙酸;B相为85%的乙腈水溶液,含0.1%的乙酸.分析条件是:0～20 min,0%～80%的B相;20～21 min,80%～100%的B相;21～25 min,100%的B相;25～30 min,0%的B相.流速为1 mL·min-1,检测波长为254 nm.

2.1 S. albovinaceus DSM 40136次级代谢产物生产潜能的分析

通过将菌株的全基因组序列上传至开源生物信息学分析平台antiSMASH,发现菌株具有24个次级代谢产物生物合成基因簇(见表1).其中与环肽(包括环二肽)相关的NRPS类生物合成基因簇至少有6个,这说明菌株具有较高的肽类次级代谢产物发掘前景.但菌株内部的分析结果并未发现CDPS类生物合成基因簇,这表明在菌株中可能不存在利用氨酰-tRNA直接合成环二肽的生物合成途径.

2.2 S. albovinaceus DSM 40136的盐胁迫培养与代谢产物生产激活

针对菌株的分析结果,筛选放线菌可用的各类发酵培养基培养菌株,并进行代谢产物分析,同时在相同的培养基中添加质量分数为3%的海盐进行菌株的胁迫培养.从M-ISP4和M-ISP4+3%海盐的培养代谢产物HPLC的对比分析结果中发现:菌株能够在含有质量分数为3%的海盐胁迫下激活生产一个新产物,且该产物信号保留时间为13～14 min(见图1).

表1 Streptomyces albovinaceus DSM 40136次级代谢产物生物合成基因簇的分析结果

(i)M-ISP4培养基;(ii)M-ISP4+3%海盐;*为新产物信号.

用5 L含海盐质量分数为3%的M-ISP4培养基进行扩大规模培养，富集萃取产物，并进行化合物的分离纯化，获得约6 mg白色粉末的目标产物纯品.

2.3 Cyclo(L-Pro-L-Leu)的结构鉴定

通过NMR分析(见图2和图3),目标产物的结构特征数据如下:

1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δH:4.20(1H,t,J=8.0 Hz,H-6),4.01(1H,dd,J=5.6,6.4 Hz,H-9),3.39(2H,m,H-3),2.15(1H,m,H-5a),1.94(1H,m,H-5b),1.85(2H,m,H-4),1.81(2H,m,H-10),1.38(1H,m,H-11),0.87(3H,d,J=6.4 Hz,H-12),0.86(3H,d,J=6.4 Hz,H-13).

13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δC:170.5(C,C-1),166.7(C,C-7),58.5(CH,C-6),52.7(CH,C-9),44.9(CH2,C-3),37.8(CH2,C-10),27.5(CH2,C-5),24.1(CH,C-11),22.9(CH2,C-4),22.5(CH3,C-12),22.0(CH3,C-13).

图2 Cyclo(L-Pro-L-Leu)的1H NMR分析图

图3 Cyclo(L-Pro-L-Leu)的13C NMR分析图

通过与文献报道结果对比，将目标产物的结构确定为具有抗肿瘤、免疫及代谢调控等多种活性的环二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu)[15].结果进一步证明该菌株含有合成该环二肽分子的功能基因，可用于后续生物合成及代谢工程研究与开发.

本文通过盐胁迫策略成功激活了S.albovinaceusDSM 40136生产环二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu).研究结果表明:盐胁迫是一项切实可靠的OSMAC发掘策略，且可用于陆生放线菌菌株的次级代谢产物开发.此外，本文发掘了1株可生产具有良好生物学活性的环二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu)的菌株，该菌株可用于后续环二肽生物合成机制研究与代谢工程改造，促进放线菌菌株资源的综合研究与利用.