纽甜液相色谱检测方法优化

董立君，赛丽诺，孟千军，张贵秋，王珊珊，张晓晓

（1.潍坊市产品质量检验所，山东潍坊 261000；
2.潍坊市检验检测中心，山东潍坊 261000）

纽甜是一种白色结晶粉末状物质，由美国孟山都公司和法国里昂大学联合研制，1993年取得化合物专利，2013年9月专利到期，从而在全球得到广泛应用[1]。纽甜作为一种非营养类增甜剂，甜度为蔗糖的8 000～10 000倍，稳定性较好，在450 ℃高温焙烤后仍有85%存在[2]。此外，纽甜在血液中存留时间较短，能被人体代谢，同时代谢产物不会在体内积累，是一种相对安全的人工合成甜味剂。

纽甜具有以下特征：①稳定性好，不会对香味、色泽、透明性、黏性等稳定性指标产生影响；
②甜味纯净，没有苦、酸、金属的异味；
③在低浓度0.5 μg·mL-1时，也具有增强改善风味的作用；
④无论是在高于或者低于甜度阈值使用，均具有风味休整和增强口味的特征。因为纽甜作为人工合成甜味剂有稳定性好、甜度高、成本低等优点，目前被广泛应用在食品生产加工中。但由于技术壁垒可能存在一定的安全隐患，添加超量或违法添加等情况不利于人类的健康，对此食品安全国家标准《GB 2760—2014》中对其添加量有详细规定。

在现行有效的食品安全国家标准GB 5009.247—2016[3]中，流动相采用了离子对试剂缓冲液和梯度洗脱的方式，但在实际工作中发现此方法目标物附近出现干扰峰。为有效解决此问题，特对方法进行优化。

样品选择虾油萝卜，其成分比较简单，等度洗脱完全可以较好分离定量纽甜。纽甜在干燥的贮存条件下非常稳定，但制成水溶液后其稳定性会随着pH和温度的改变而显著变化，文献表明其在pH 3.0～5.5相对稳定[4]，所以选择1.5 g·L-1磷酸氢二铵溶液（用1 mol·L-1磷酸溶液调pH为3.0～3.5）和乙腈作为流动相（使用时配制）。

1.1 试剂与仪器

磷酸氢二铵：分析纯、上海光复；
三乙胺、甲酸：色谱纯、科密欧；
乙腈：色谱纯、美国赛默飞世尔科技公司；
纽甜标准品（CAS号：165450-17-9）：北京坛墨、纯度99%；
固相萃取柱：HLB SPE Cartridge 200 mg/6 mL（60 μm）；
Vanquish Core 高效液相色谱仪（配紫外检测器）：美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件的选择

色谱柱：纳普C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
柱温：30 ℃；
流速：1 mL·min-1；
进样量：10 μL；
检测波长：218 nm；
流动相：乙腈∶磷酸氢二铵溶液（0.02 mol·L-1）=30 ∶ 70；
洗脱方式：等度。

1.2.2 标准工作液的配制

取1 000 μg·mL-1标准溶液用混合提取液（吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 000 mL，pH约为 4.5）配制成浓度分别为 0.2 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和 20.0 μg·mL-1标准工作液。

1.2.3 试验设计

各准确称取10 g（精确到0.000 1 g）虾油萝卜将其匀浆置于3个50 mL具塞离心管中，依次加入100 μg·mL-1标准溶液 20 μL（定量限）、100 μL（5 倍定量限）和 1 000 μg·mL-1标准溶液 100 μL（酱腌菜纽甜限量0.01 g·kg-1），然后各加入30 mL混合提取液，混匀超声15 min，用混合提取液定容至刻度。分别离心取10 mL上清液，以1 mL·min-1的流速通过HLB固相萃取柱，弃去流出液，用5 mL甲醇以1 mL·min-1的流速洗脱，40 ℃水浴氮吹浓缩，混合提取液定容至2 mL，过滤膜（0.45 μm）上机。同时做空白试验。

2.1 相同浓度不同方法色谱图对比

将标准溶液上机测试，10 μg·mL-1浓度点优化后的色谱图相较标准方法明显没有干扰峰，更有利于目标物的定性。10 μg·mL-1浓度点优化后的方法和标准方法色谱图如图1所示。

图1 10 μg·mL-1浓度点优化后的方法和标准方法色谱图（上图为优化方法，下图为标准方法）

2.2 定量限的确定

按照国家标准GB 5009.247—2016[3]中的计算公式，当定量限为 0.2 mg·kg-1时，检测浓度为 0.2 μg·mL-1，信噪比为64.2，大于10符合要求。定量限检测浓度0.2 μg·mL-1色谱图如图 2 所示。

图2 定量限检测浓度0.2 μg·mL-1色谱图

2.3 回收率测定

取虾油萝卜按1.2.3试验过程进行前处理，上机测试空白值为 0 μg·mL-1，同时在定量限、5 倍定量限和酱腌菜纽甜限量值0.01 g·kg-13个点做加标，被测组分含量分别为 0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1，回收率分别为88.2%、91.4%、94.1%，分别满足GB/T 27404—2008[5]中80%～110%、80%～110%、90%～110%的要求。

2.4 校准曲线

上述标准溶液浓度点按照1.2.1的色谱条件上机测试，得出的R2为0.999 9，满足GB/T 27404—2008[5]中R2不应低于0.99的要求。

2.5 精密度试验

以实验室变异系数（Coefficient of Variation，CV）来反应精密度的好坏。CV越小精密度越好，CV越大精密度越差。上述试验3个加标回收样品，折回收率实际值分别为 0.176 μg·mL-1、0.914 μg·mL-1、9.410 μg·mL-1，按照1.2.1 的色谱条件各重复进样7次，结果见表1。

由表1可知，上述试验设计3个加标回收样品连进7针实验室内变异系数（CV）值均小于5%，满足GB/T 27404——2008要求。

表1 不同浓度精密度实验结果（单位：μg·mL-1）

采取磷酸氢二铵溶液、乙腈作为流动相和等度洗脱方式，目标物的干扰峰消失，解决了实际工作中定性的问题。同时，对优化的方法进行方法确认，试验结果表明定量限浓度信噪比为64.2，大于10符合要求；
被测组分含量分别为 0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1回收率分别为88.2%、91.4%、94.1%，均满足GB/T 27404—2008回收率的要求；
R2为0.999 9，满足GB/T 27404—2008相关系数不应低于0.99的要求；
3个加标回收样品连进7针CV值小于5%，精密度满足GB/T 27404-2008要求。优化的方法既排除了目标物干扰问题，也因为磷酸氢二铵作为实验室常用流动相可参与检测多个物质而有效提高工作效率。