circ_0046263靶向miR-1184调控肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

刘文东 张嘉麟 余紫丹（惠州市第三人民医院肿瘤科，惠州 516001）

肝细胞癌是全球癌症病死率较高的肿瘤，多数患者确诊时已是晚期，预后较差，肝癌监测和早期发现增加了治愈的机会；
分子靶向疗法已在临床上用于多种癌症治疗，研究导致肝癌发展和进展的各种分子机制，筛选特异性靶点、开发更多靶向特定途径的药物对肝癌诊断及治疗具有重要意义［1-2］。环状RNA（circRNA）是真核生物中具有特异性的共价封闭内源性生物分子，可通过充当microRNA或蛋白抑制剂在多种疾病中发挥重要生物学功能，可作为多种类型癌症的诊断或治疗靶标［3-4］。研究报道，circ_0046263在鼻咽癌细胞系和组织中均表达上调；
敲除circ_0046263可抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移［5］。circ_0046263在非小细胞肺癌中明显上调；
敲除circ_0046263对非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期和转移具有抑制作用［6］。但circ_0046263在肝癌细胞中的作用及机制尚不清楚。本研究通过在线软件预测发现circ_0046263与miR-1184存在结合位点。研究报道，miR-1184在结肠癌细胞和组织中表达显著下调；
miR-1184过表达通过抑制Ki67表达抑制结肠癌细胞增殖，并通过上调cleaved caspase-3和 下调Bcl-2表达促进 其凋亡［7］。沉默circVANGL1通过上调miR-1184表达抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移和增殖［8］。说明miR-1184可能在癌症中起抑癌作用。但miR-1184在肝癌中的作用及circ_0046263是否调控miR-1184表达尚不清楚。因此，本实验以肝癌细胞株HCCLM3为研究对象，探究circ_0046263是否影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭及其机制是否与miR-1184有关。

1.1 材料

1.1.1 组织来源选取惠州市第三人民医院2017年1月至2020年12月经病理检测为肝癌且具有完整临床病理资料的患者47例，其中男29例，女18例，年龄42～78岁，平均（56.7±2.1）岁。手术切除其肿瘤组织及癌旁组织，距肿瘤组织边缘5 cm处切除的为癌旁组织，所有患者术前均未接受过任何放化治疗或免疫治疗，且知情同意。

1.1.2 主要试剂肝癌细胞株HCCLM3购自美国ATCC；
RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；
Trizol试剂购自厦门慧嘉生物科技有限公司；
荧光定量试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司；
CCK-8试剂盒购自日本同仁研究所；
吉姆萨染色液购自广州达晖生物技术股份有限公司；
Transwell小室、Matrigel购自美国Corning公司；
RIPA蛋白裂解液购自北京百奥莱博科技有限公司；
双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海臻诺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组肝癌细胞株HCCLM3采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5%CO2条件下培养，2 d换液1次，细胞融合至90%左右时消化传代，取对数生长期细胞，转染si-NC、si-circ_0046863、miR-NC、miR-1184，6 h后换新鲜培养基继续培养，记为si-NC组、si-circ_0046863组、miR-NC组、miR-1184组；
将si-circ_0046263分别与anti-miR-NC、anti-miR-1184共转染至HCCLM3细胞，记为si-circ_0046263+anti-miR-NC组、si-circ_0046263+anti-miR-1184组。

1.2.2 RT-qPCR检 测circ_0046263和miR-1184表达取适量肝癌组织、癌旁组织，加入Trizol试剂提取总RNA，用同样方法提取各组HCCLM3细胞总RNA，合成cDNA后进行荧光定量PCR，以GAPDH和U6为内参，PCR反应体系：2μl反转录产物、10μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5μl、7μl无菌水；
循环条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环；
溶解曲线：95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。2-ΔΔCt计算相对表达。circ_0046263正向引物序列：5"-ACCATTTGGGATCACTTCCA-3"，反 向引 物 序列：5"-CTTCTTCAGCCAGTTCACGA-3"；
GAPDH正向引物序列：5"-GTGAACCATGAGAAGTATG-3"，反向引物序列：5"-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3"；
miR-1184正向引物序列：5"-CCTGCAGCGACTTGATGGC-3"，反向引物序列：5"-GAACATGTCTGCGTATCTC-3"；
U6正向引物序列：5"-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCA-3"，反向引物序列：5"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3"；
引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 CCK-8检测细胞活性取各组对数生长期HCCLM3细胞，消化后接种至96孔板，常规培养24 h，加入10μl CCK-8试剂孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度（OD）。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成数将各组HCCLM3细胞以200个/孔接种于6孔板，培养2周，终止培养后PBS洗涤2次，甲醇固定15 min后加入吉姆萨染色液染色30 min，光学显微镜下计数＞50个细胞的集落。

1.2.5 划痕实验检测划痕愈合率取各组对数生长期细胞，消化后接种于培养皿，待细胞铺满皿底后用枪头划痕，PBS冲洗，更换新鲜培养液继续培养，培养0 h和24 h后拍照观察，Image-Pro Plus 6.0软件计算划痕愈合率。

1.2.6 Transwell检测侵袭细胞数取100μl稀释的Matrigel平铺于Transwell上室，凝固后接种100μl无血清重悬的细胞，下室加入500μl含血清培养液，培养24 h后取出Transwell小室，弃培养液，PBS洗2遍，甲醇固定30 min，将小室风干，0.1%结晶紫染色20 min，棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS漂洗，干燥，光学显微镜下随机选择5个视野并计数。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达 提取各组HCCLM3细胞总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入E-cadherin和N-cadherin一抗（1∶800）37℃孵育2 h，加入二抗山羊抗兔IgG（1∶1 500）室温孵育2 h，暗室曝光显影，分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算蛋白相对表达。

1.2.8 双荧光素酶报告实验构建circ_0046263野生型（WT-circ_0046263）和突变型（MUT-circ_0046263）荧光素报告酶载体，将miR-NC和miR-1184分别与其共转染至HCCLM3细胞，按照说明书检测荧光素酶活性。将pcDNA、pcDNA-circ_0046863、si-NC、si-circ_0046863分别转染至HCCLM3细胞，RT-qPCR检测miR-1184表达。

1.3 统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 circ_0046263和miR-1184在肝癌组织中的表达收集肝癌患者癌组织及癌旁组织，RT-qPCR检测circ_0046263和miR-1184表达，结果显示，肝癌组织circ_0046263表达高于癌旁组织，miR-1184表达低于癌旁组织（P＜0.05，表1），表明肝癌组织中circ_0046263呈高表达，而miR-1184呈低表达。

表1 肝癌组织circ_0046263和miR-1184表达（±s，n=47）Tab.1 Expressions of circ_0046263 and miR-1184 in liver cancer tissue（±s，n=47）

表1 肝癌组织circ_0046263和miR-1184表达（±s，n=47）Tab.1 Expressions of circ_0046263 and miR-1184 in liver cancer tissue（±s，n=47）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

Groups Adjacent tissues Liver cancer tissues t P circ_0046263 1.00±0.08 3.53±0.311）32.763 0.000 miR-1184 1.00±0.07 0.33±0.031）60.313 0.000

2.2 抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞增殖的影响RT-qPCR检测发现，转染si-circ_0046263后circ_0046263表达降低；
克隆形成实验中si-circ_0046263组HCCLM3细胞克隆形成数少于si-NC组（P＜0.05），CCK-8实验中，si-circ_0046263组HCCLM3细胞活性低于si-NC组（P＜0.05，图1、表2），表明抑制circ_0046263表达可抑制HCCLM3细胞增殖和克隆形成。

表2 抑制circ_0046263表达抑制肝癌HCCLM3细胞增殖（±s，n=9）Tab.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits proliferation of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表2 抑制circ_0046263表达抑制肝癌HCCLM3细胞增殖（±s，n=9）Tab.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits proliferation of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-circ_0046263 tP circ_0046263 1.00±0.00 0.24±0.021）114.000 0.000 OD450 0.65±0.04 0.32±0.031）19.800 0.000 Cell clone formation 78.08±6.17 35.06±3.241）18.519 0.000

图1 抑制circ_0046263表达抑制肝癌HCCLM3细胞克隆形成Fig.1 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits clonal formation of HCCLM3 cells

2.3 抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞迁移、侵袭的影响转染si-circ_0046263及阴性对照si-NC后，划痕实验结果显示，si-circ_0046263组HCCLM3细胞划痕愈合率低于si-NC组，Transwell结果显示，si-circ_0046263组HCCLM3细胞侵袭数少于si-NC组，Western blot结果显示，si-circ_0046263组E-cadherin表达高于si-NC组，而N-cadherin表达低于si-NC组（P＜0.05，图2、表3），表明抑制circ_0046263表达可抑制肝癌HCCLM3细胞迁移侵袭。

表3 抑制circ_0046263表达可抑制肝癌HCCLM3细胞迁移、侵袭（±s，n=9）Tab.3 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表3 抑制circ_0046263表达可抑制肝癌HCCLM3细胞迁移、侵袭（±s，n=9）Tab.3 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-circ_0046263 t P Scratch healing rate（%）63.92±5.02 22.53±2.091）22.835 0.000 Invasive cell number 99.61±9.14 42.94±4.121）16.957 0.000 E-cadherin protein 0.13±0.02 0.55±0.041）28.174 0.000 N-cadherin protein 0.66±0.05 0.25±0.021）22.841 0.000

图2 抑制circ_0046263表达可抑制肝癌HCCLM3细胞迁移、侵袭Fig.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells

2.4 circ_0046263靶向调控miR-1184表达circular RNA Interactome预测显示，circ_0046263与miR-1184存在互补核苷酸序列（图3）。双荧光素酶报告实验结果显示，WT-circ_0046263与miR-1184共转染后的细胞荧光素酶活性降低，而MUT-circ_0046263与miR-1184共转染后的细胞荧光素酶活性无显著变化（表4）。RT-qPCR结果显示，pcDNAcirc_0046263组miR-1184表 达 低 于pcDNA组；
si-circ_0046263组miR-1184表达高于si-NC组（P＜0.05，表5）。表明circ_0046263可靶向调控miR-1184表达。

图3 circ_0046263序列中含有与miR-1184互补的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circ_0046263 contains a nucleotide sequence complementary to miR-1184

表4 circ_0046263野生型和突变型载体与miR-NC、miR-1184共转染后的荧光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Luciferase activity of circ_0046263 wild-type and mutant vectors co-transfected with miR-NC and miR-1184（±s，n=9）

表4 circ_0046263野生型和突变型载体与miR-NC、miR-1184共转染后的荧光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Luciferase activity of circ_0046263 wild-type and mutant vectors co-transfected with miR-NC and miR-1184（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-1184 t P WT-circ_0046263 1.03±0.07 0.61±0.061）13.667 0.000 MUT-circ_0046263 1.04±0.08 1.01±0.06 0.900 0.381

表5 circ_0046263调控miR-1184表达（±s，n=9）Tab.5 circ_0046263 regulates expression of miR-1184（±s，n=9）

表5 circ_0046263调控miR-1184表达（±s，n=9）Tab.5 circ_0046263 regulates expression of miR-1184（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；
compared with si-NC group，2）P＜0.05.

Groups pcDNA pcDNA-circ_0046263 si-NC si-circ_0046263 F P miR-1184 1.00±0.00 0.38±0.041）0.98±0.06 3.13±0.312）517.276 0.000

2.5 miR-1184过表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的影响RT-qPCR结果发现，转染miR-1184后，miR-1184表达升高；
克隆形成实验中miR-1184组HCCLM3细胞克隆形成数少于miR-NC组（P＜0.05），CCK-8实 验 中，si-circ_0046263组HCCLM3细胞活性低于si-NC组，划痕实验结果显示，si-circ_0046263组HCCLM3细胞划痕愈合率低于si-NC组，Transwell结果显示，si-circ_0046263组HCCLM3细胞侵袭数少于si-NC组，Western blot结果显示，si-circ_0046263组E-cadherin表达高于si-NC组，而N-cadherin表达低于si-NC组（P＜0.05，图4、表6）。表明miR-1184过表达可抑制肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭。

表6 miR-1184过表达抑制肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1184 inhibits proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表6 miR-1184过表达抑制肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1184 inhibits proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-1184 t P miR-1184 1.00±0.00 2.67±0.221）22.773 0.000 OD450 0.68±0.04 0.39±0.041）15.380 0.000 Cell clone formation 77.81±6.49 42.29±3.621）14.339 0.000 Scratch healing rate（%）64.87±5.19 28.56±3.291）17.727 0.000 Invasive cell number 96.83±8.22 49.67±5.421）14.369 0.000 E-cadherin protein 0.12±0.02 0.48±0.041）24.150 0.000 N-cadherin protein 0.68±0.05 0.30±0.031）19.551 0.000

图4 miR-1184过表达抑制肝癌HCCLM3细胞迁移、侵袭相关蛋白表达Fig.4 Overexpression of miR-1184 inhibits expressions of proteins related to migration and invasion of liver cancer HCCLM3 cells

2.6 下调miR-1184表达逆转了抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的作用si-circ_0046263与anti-miR-1184共转染后miR-1184表达降低，克隆形成实验中si-circ_0046263+anti-miR-1184组HCCLM3细胞克隆形成数多于si-circ_0046263+anti-miR-NC组（P＜0.05），CCK-8结果显示，si-circ_0046263+anti-miR-1184组HCCLM3细胞活性高于si-circ_0046263+anti-miR-NC组，划痕实验结果显示，si-circ_0046263+anti-miR-1184组HCCLM3细胞划痕愈合率高于si-circ_0046263+antimiR-NC组，Transwell结果显示，si-circ_0046263+anti-miR-1184组HCCLM3细胞侵袭数多于si-circ_0046263+anti-miR-NC组，Western blot结 果 显 示，si-circ_0046263+anti-miR-1184组E-cadherin表 达 低于si-circ_0046263+anti-miR-NC组，而N-cadherin表达 高 于si-circ_0046263+anti-miR-NC组（P＜0.05，表7、图5）。表明下调miR-1184表达逆转了抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

表7 下调miR-1184表达逆转了抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的作用（±s，n=9）Tab.7 Down-regulation of miR-1184 expression reversed effect of inhibiting circ_0046263 expression on proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表7 下调miR-1184表达逆转了抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的作用（±s，n=9）Tab.7 Down-regulation of miR-1184 expression reversed effect of inhibiting circ_0046263 expression on proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-circ_0046263+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-circ_0046263+anti-miR-NC si-circ_0046263+anti-miR-1184 t P miR-1184 1.00±0.00 0.27±0.031）73.000 0.000 OD450 0.31±0.03 0.57±0.041）15.600 0.000 Cell clone formation 33.82±4.58 69.14±6.021）14.008 0.000 Scratch healing rate（%）23.33±2.84 56.09±4.751）17.758 0.000 Invasive cell number 41.36±4.83 86.94±8.121）14.473 0.000 E-cadherin protein 0.57±0.05 0.25±0.021）17.827 0.000 N-cadherin protein 0.22±0.02 0.51±0.041）19.454 0.000

图5 下调miR-1184表达逆转了抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的作用Fig.5 Down-regulating expression of miR-1184 reversed effect of inhibiting expression of circ_0046263 on expressions of proteins related to migration and invasion of liver cancer HCCLM3 cells

近年分子靶向药物治疗已成为肝癌研究热点，其可明显改善患者疗效；
但目前分子靶向治疗尚未成熟，急需发现新的分子靶点以开发相应靶向药物［9-11］。研究表明，circRNA可通过调节多种生物学过程在肝癌进程中发挥致癌作用或抑制作用，具有作为预后生物标志物及肝癌治疗靶标的潜力［12］。如circTRIM33-12充当miR-191的海绵，可抑制肝细胞癌增殖、迁移、侵袭和免疫逃逸［13］。circSETD3通过调控miR-421抑制肝细胞癌生长［14］。本研究发现，肝癌组织中circ_0046263表达升高，提示circ_0046263在肝癌中起促癌作用。进一步抑制circ_0046263表达后，肝癌细胞HCCLM3活性降低，细胞克隆形成数减少，细胞划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少，且E-cadherin表达升高，N-cadherin表达降低，表明抑制circ_0046263表达抑制了肝癌细胞HCCLM3增殖、迁移和侵袭。

研究报道，circ_0128846通过使miR-1184海绵化并释放AJUBA使Hippo/YAP信号失活，从而促发结直肠癌［15］。干扰circBC048201表达可通过miR-1184/ITGA3轴抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭［16］。表明miR-1184不仅影响肿瘤进展，还可被circRNA调控。本研究结果显示，肝癌组织中miR-1184呈低表达，过表达miR-1184后，肝癌细胞HCCLM3活性降低，细胞克隆形成数减少，细胞划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少，E-cadherin表达升高，N-cadherin表达降低；
说明过表达miR-1184可抑制肝癌细胞进展。本研究还发现circ_0046263靶向调控miR-1184表达；
下调miR-1184表达逆转了抑制circ_0046263表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

综上所述，抑制circ_0046263表达可能通过靶向上调miR-1184表达抑制肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭。