高效液相色谱法快速测定小麦粉中的偶氮甲酰胺

王若男，杨慧晴，赵俊峰，钟建权，卢婉婷，周棣杨

（广东省绿色产品认证检测中心有限公司，广东 广州 510440）

偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ADA），又名偶氮二甲酰胺，无气味、淡黄色固体粉末。加拿大、中国等国家将它作为一种面粉的增筋剂使用[1-2]。在面粉加水制面团时，偶氮甲酰胺遇水会释放出活性氧，活性氧将小麦蛋白质氨基酸的巯基（—SH）氧化为二硫键（—S—S），蛋白质链相互连接，形成网状结构，面团的强度显著提升[3]。实验研究表明，当偶氮甲酰胺达到一定浓度时会诱发人类哮喘和人皮肤的致敏反应[3-5]。在食品的加工过程中，偶氮甲酰胺在高温高湿的环境下会分解双缩脲（biurea，BIU）和氨基脲（semicarbazide，SEM），实验表明，SEM对人类健康具有潜在的致癌和诱变作用[3]。欧盟等国家已经明令禁止使用偶氮甲酰胺，我国现行使用的GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定小麦粉中偶氮甲酰胺的使用限量为0.045 g/kg。

目前，偶氮甲酰胺的检测主要是通过高效液相紫外检测器法/质谱法[6]，主要分为直接检测法和通过衍生增加基团的方法，直接检测法操作简单，检测成本低。但是，丙酮和乙腈溶剂的溶解度低，通过浓缩增加检测器的响应，增加了检测过程中的损耗[7]。衍生反应增加基团转化成其他物质通过液质液相间接测定，可以提高检测的准确度、灵敏度、仪器的响应度，但是衍生过程长，检测难度增加[8]。本文建立了一种快速检测面粉中偶氮甲酰胺的方法，用N，N-二甲基甲酰胺提取面粉中的偶氮甲酰胺，并直接进行衍生，用高效液相色谱紫外检测器对产物进行定性定量分析，能够满足小麦粉样品的检测要求，并且操作简单，实验方法较同类实验所花时间短。

1.1 材料

样品，超市购买；
偶氮甲酰胺标准品，纯度99.0%，上海安谱催世标准技术服务有限公司；
N-N 二甲基甲酰胺，分析纯，麦克林；
三苯基膦，色谱纯，麦克林；
无水硫酸钠，分析纯，广州化学试剂厂；
甲醇，色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司；
实验用水，符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中一级水的规定。

1.2 设备

高效液相色谱仪配紫外检测器，thermo scientific UltiMate 3000；
立式高速冷冻离心机，HR/T20MM，湖南赫西仪器装备有限公司；
多管涡旋混合器，EFAA-HM-01，上海安谱实验科技股份有限公司；
水浴恒温振荡器，SHZ-C，上海跃进医疗器械有限公司；
超声波清洗机，钰洁。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取10.00 mg 偶氮甲酰胺标准品，用N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容至100 mL，混匀，配置成质量浓度为100 μg/mL 的标准储备液，0 ℃～4 ℃避光保存。

1.3.2 样品处理方法

称取2.50g小麦粉，加入1g无水硫酸钠，加入25mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，振荡10 min，以10 000 r/min，离心10min，取上清液待衍生。准确移取1mL 上清液于15 mL 离心管中，加入0.1mL 10 mg/mL 三苯基衍生溶液，混合均匀，放入40℃水浴振荡器上，避光衍生，过0.22 μm 微孔有机滤膜，供液相色谱上机。使用空白小麦粉按照样品处理方法进行处理，得到空白基质提取液。

1.3.3 工作液曲线的配置

分别取样品10、50、100、300、600、1 000 μL 于10 mL 容量瓶中，用空白基质提取液定容至10 mL，分别取1 mL 于15 mL 离心管中,与样品同时进行衍生。

1.4 色谱分析条件

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温35℃，流速1.0 mL/min，洗脱流动相V（甲醇）∶V（水）=55∶45，波长230 nm，进样量5 μL。

2.1 前处理条件的讨论

2.1.1 提取溶剂选择

主要考虑偶氮甲酰胺的溶解性问题，偶氮甲酰胺不溶于水和醇，在丙酮、乙腈、二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺中，丙酮和乙腈中的溶解性较差，二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的溶解性较好。二甲基亚砜的黏稠度大，增加了前处理难度。偶氮甲酰胺室温时在N，N-二甲基甲酰胺的溶解度能达到390 μg/mL[8]，完全可以满足检测要求。

2.1.2 衍生剂浓度的选择。

用质量浓度100 μg/mL 的标准溶液进行验证，根据实验验证表明，当衍生剂质量浓度达到10 mg/mL时，衍生后的物质峰面积达到最大，再增加衍生剂时峰面积几乎不变。

2.1.3 衍生过程优化

同类实验的衍生过程为移取1 mL 上清液于15 mL离心管中，加入0.1 mL 衍生溶液，混合均匀，避光静置衍生12 h 以上，室温下避光静置衍生12 h 以上的工作液，峰面积与浓度之间关系如图1 所示。

图1 12 h 静置衍生后的标准工作液曲线

先后尝试了超声和加热振荡两种方式来加快衍生反应，缩短衍生反应时间，选取了质量浓度0.5 mg/L和10 mg/L 的工作液进行实验。图2 表示超声衍生曲线变化图，直到2 h 以后衍生产物的增加速率减小，当超声2 h 时衍生产物峰面积达到静置12 h 时的85%（工作液0.5 mg/L）和75%（工作液10 mg/L），回收率达到要求。图3 和图4 表示40 ℃和50℃加热衍生曲线变化图，2 h 以后衍生产物的增加速率减少，当40 ℃加热2 h 时衍生产物峰面积达到静置12 h 时的124%（工作液0.5 mg/L）和82%（工作液10 mg/L），50℃加热2 h 时衍生产物峰面积达到静置12 h 时的145%（工作液0.5 mg/L）和98%（工作液10 mg/L），加热温度的增加响应值也增加，同时考虑经济效应和实验回收率的问题，本文选用40 ℃加热2 h 的方式进行衍生，这样前处理缩短时间至3 h 以内，显著提高检测效率。

图2 超声衍生曲线变化图

图3 40 ℃加热衍生曲线变化图

图4 50 ℃加热衍生曲线变化图

2.2 色谱条件选择

色谱柱的选择：本文实验了3 种色谱柱，根据分离情况和峰形改善，发现Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）效果良好，其色谱图如图5所示。

图5 产物HPLC 色谱图

2.3 线性范围和检出限

配制不同浓度的标准品得到不同浓度标准溶液工作曲线，其曲线如图6 所示，同时用信噪比算出检出限1.3 mg/kg 和定量限4.3 mg/kg。

图6 40 ℃加热工作液曲线图

2.4 方法的回收率和精密度

准确称取空白样品18 份，每份2.50 g，共3 组，分别定量加入高、中、低3 个浓度的偶氮甲酰胺标准品，结果见表1，加标回收率97.7%～103.0%，相对标准偏差为0.9%～2.3%。

表1 空白样品加标回收率和精密度

偶氮甲酰胺作为食品添加剂被许多国家允许使用，国家对偶氮甲酰胺的使用设定了限值。本文建立了一种快速检测面粉中偶氮甲酰胺的方法，用N，N-二甲基甲酰胺提取面粉中的偶氮甲酰胺，并直接进行衍生，用高效液相色谱紫外检测器对产物进行定性定量。结果表明，该方法回收率高，线性好，精密度高，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。