植物乳杆菌XCT1-1对鸡肉表面耐药大肠杆菌的抑制作用

吕欣然，李叙波，孙 悦，佟鑫瑶，杜 宏，白凤翎，张德福

(渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁 锦州121013)

由于抗菌药物的不合理使用，导致多种微生物对常见药物产生耐药性问题，因此，耐药菌成为人类在医疗、农业、食品等领域中备受关注的问题．大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，也称为大肠杆菌，是一种常见的食源性致病菌[1]，普遍出现在肉制品、乳制品和蔬菜等食品和农产品中．鸡肉及其制品已成为我国民众第二大肉类蛋白消费来源，但其极易受大肠杆菌的污染，人类食用后可出现胃痛、发热、肠道感染、腹泻等症状[2]．研究表明，常使用头孢拉定、链霉素、红霉素等抗生素治疗大肠杆菌引起的食源性疾病．但这些抗生素的频繁使用易使大肠杆菌出现耐药性，并且耐药性可在细菌间快速传播形成多重耐药菌[3]．因此,急需研发出一种安全且能够阻止多重耐药菌生长的抗菌剂．生物抗菌剂具备安全、高效、无毒、无害以及不易出现耐药性等要素，逐渐成为传统抗生素的替代品[4]．乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是一类新型生物抗菌剂，已被发现在乳制品、肉制品、水产品等食品分类中表现出良好的使用效果，其主要通过产生细菌素、有机酸等代谢物质来对抗细菌的生长繁殖[5]．Perales-Adn等[6]发现乳酸菌产生的圆形细菌素AS-48和羊毛硫抗生素乳链菌肽细菌素能够抑制耐药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长繁殖，当二者联合使用时，最低抑菌浓度下降至0．04～0．05 μmol/L之间．Kumar等[7]研究发现植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌均可以抑制多重耐药性肠聚合性大肠杆菌(Multidrug-Resistant EnteroaggregativeEscherichiacoli，MDR-EAEC)生长，并且两者协同作用更显著，体内感染小鼠发现两株乳酸菌均能有效清除体内MDR-EAEC．课题组前期研究发现，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XCT1-1产生的细菌素对耐阿奇霉素的大肠杆菌具有良好的抑制作用[8]，但其是否能在鸡肉产品中保持良好的作用还有待研究．

本文在前期研究基础上，通过测定细菌菌落总数、pH、TVB-N、持水力等指标评价菌株XCT1-1细菌素粗提物对鸡肉中耐药性大肠杆菌的抑制作用及品质的影响，以期为开发控制肉制品中耐药性致病菌的乳酸菌生物抗菌剂提供理论基础．

1．1 材料与仪器

1．1．1 样品与菌株

新鲜鸡胸脯肉：购于辽宁省锦州市金凌市场．

供试菌：植物乳杆菌XCT1-1，目标菌：耐阿奇霉素E．coli0001，两者均存于本校微生物学与分子生物学实验室．

1．1．2 培养基与试剂

LB肉汤、MRS肉汤、MRS琼脂培养基、平板计数培养基(PCA)、麦康凯培养基、北京奥博星生物技术有限公司；
阿奇霉素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司．

1．1．3 仪器与设备

SW-CJ-1D型超净工作台，苏州博莱尔净化设备；
KS50R台式高速冷冻离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；
SPX-150生化培养箱，金坛经济开发区吉特实验仪器厂；
上海菁华723PC可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；
美国OHAUS奥豪斯pH检测仪AB33，深圳市怡华新电子有限公司；
SARTORIUS赛多利斯普及型精密天平GL2201-1SCN，季尔国际贸易(上海)有限公司；
MixMax涡旋仪，合肥艾本森科学仪器有限公司；
全自动立式高压蒸汽灭菌器，山东博科灭菌技术有限公司；
YRE-10-50L旋转蒸发器，羽中仪器；
DZF-6020A型真空干燥箱，力辰科技；
上海沛欧SKD-1000全自动凯氏定氮仪，上海沛欧．

1．2 方法

1．2．1 植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物的制备

将于-80 ℃冰箱保藏的植物乳杆菌XCT1-1以2%的接种量在10 mL MRS肉汤中活化传代2次，接下来以同样的接种量接种于1 000 mL MRS肉汤中，37 ℃下培养12 h后得到乳酸菌发酵液，4 ℃下 10 000 r/min离心15 min，用0．45 μm无菌滤菌器过滤得菌株XCT1-1无细胞上清液(Cell Free Supernatants，CFS)．将CFS(100 mL)置于分液漏斗中，分5次加入100 mL乙酸乙酯，混匀后静置5 min，待分层后收集有机相，将其置于50 ℃下真空旋转蒸发消除有机溶剂，收集瓶中余液，在55 ℃，100 r/min的真空条件下，将液体进行旋转蒸发，以其颜色澄清为终点，而后将处理好的澄清液体统一保存．接下来选择真空度0．420、温度为-40 ℃，进行为期48 h的真空冷冻干燥，以澄清液体变成粉末颗粒状为准，最后处理好的样品统一收集在超低温冰箱，留存备用．

1．2．2 耐阿奇霉素大肠杆菌菌悬液的制备

将于-80 ℃冰箱保存的菌株0001按液体培养基体积的2%进行接种，即利用移液枪吸收200 μL菌液，打入10 mL LB肉汤中，在30 ℃培养箱中放置12 h，活化至3代后，利用灭菌后的生理盐水进行梯度稀释操作，直至最终浓度为1．0 × 104CFU/mL，置于4 ℃冰箱备用．

1．2．3 鸡肉接种试验

根据之前的实验结果可知：针对耐药性E．coli0001，植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物的最小抑菌浓度(MIC)为6 mg/mL[8]．选择鸡肉为研究对象[9]，利用75%乙醇喷洒鸡肉表面，使用无菌刀具将鸡肉切成10.0 g/块的鸡肉块备用，在无菌条件下将鸡肉采用浸泡法处理，浸泡30 min，捞出沥干30 min，细菌素粗提物处理的浓度为0．75 MIC，耐药性E．coli的接种浓度1．0 × 104CFU/mL，阿奇霉素的接种浓度15 μg/mL．具体处理方式见表1：

表1 菌株与鸡肉的不同处理方式

对样品进行密封包装后，存于4 ℃冰箱，进行为期10 d的冷藏，每隔2 d取样对细菌菌落总数、pH值、TVB-N值及持水性四个指标进行测定．

1．2．4 细菌菌落总数

按照GB 4789．2—2016《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》操作，准确称取处理后的鸡肉5．0 g于蒸煮袋中，分别加入无菌0．85%氯化钠45 mL，用拍打均质机拍打2 min，采用10倍逐级稀释，选择3个适宜浓度，利用PCA培养基进行菌落总数计数，在37 ℃培养箱中培养 24 h，而后对菌落总数进行计数．

1．2．5 pH的测定

按照GB 5009．237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行检测．准确称取1．2．3中处理方法的鸡肉5．0 g，分别加入无菌水45 mL，均质，在室温条件下静置20 min后，用滤网过滤除去滤渣，利用pH计记录其滤液．

1．2．6 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

参照Li等[10]的方法并略作修改．准确称取1．2．3中处理的鸡肉10．0 g于蒸馏管中，添加1．0 g轻质MgO，连接到全自动定氮仪，TVB-N以mg N/100 g表示．

1．2．7 鸡肉持水力(Water Holding Capacity，WHC)的测定

参照Castellini等[11]的方法并略作修改．取鸡肉样品5．0 g，记为W0．利用滤纸包住称得的鸡肉，而后整体放入50 mL离心管内，在温度4 ℃，转速为2 500 r/min的条件下离心，时间为10 min，记录完成离心的鸡肉样品的重量W1．将鸡肉剁碎，放在恒温箱中晾干，温度调整为60 ℃，记录烘干后的重量W2，按下列公式求得鸡肉的持水力．

式中：W0为鸡肉样品的重量；
W1离心后的肉样重量；
W2为鸡肉绞碎后烘干的重量．

1．3 数据处理

数据采用平均值±标准差的形式，每组实验做3次平行实验．利用SPSS 19．0分析数据，采用Origin 8．0作图．

2．1 细菌菌落总数

菌落计数可反映食品被细菌污染的程度[12]，是评价食品安全的重要指标．GB 16869—2005《鲜、冻禽产品》规定冻禽产品的细菌菌落总数超过5．0 log CFU/g为不合格品．

图1(a)和图1(b)分别表示细菌素粗提物单独和与阿奇霉素共同处理鸡肉样品贮藏期间细菌菌落总数变化．随着存放时间的延长，处理组和对照组的细菌菌落总数均有所增加．如图1(a)所示，对照组在第4 d均超过国家规定限量标准；
在第6 d，只有处理组A-T1的细菌菌落总数未超过5．0 log CFU/g；
8 d后所有组样品均超过国家标准；
在第10 d时，将处理组A-T1与阴性对照组A-NC进行对比，发现细菌菌落总数下降了1．76 log CFU/g；
处理组A-T2与阳性对照组A-PC相比，细菌菌落总数则下降了1．71 log CFU/g．说明植物乳杆菌XCT1-1粗提物可抑制鸡肉中细菌的生长繁殖，从而有效延长鸡肉货架期2 d．

(a)细菌素粗提物单独处理

(b)细菌素粗提物与阿奇霉素共同处理

根据图1(b)得出，在第4 d时，耐药性大肠杆菌单独处理的阴性对照组和与阿奇霉素共同处理的阳性对照组中的细菌菌落总数均超过国家标准，而两组处理组均未超过4．0 log CFU/g，即在国家规定限量标准以下；
第6 d时，处理组B-H1超过国家规定数量，处理组B-H2的结果则是4．7 log CFU/g，小于 5 log CFU/g；
贮藏后期第10 d时，对照组B-NC组与B-PC组无显著性差异(P> 0．05)，处理组B-H1和B-H2细菌菌落总数具有显著性差异(P< 0．05)．与对照组B-NC相比，处理组B-H1和B-H2细菌菌落总数分别下降了1．45 log CFU/g和2．25 log CFU/g(P< 0．05)．由此表明植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物与阿奇霉素协同作用对于对抗鸡肉中细菌的生长繁殖有较好的效果，可使感染耐药性E．coli鸡肉的货架期延期4 d．

通过分析细菌菌落总数这一指标可知，细菌素粗提物单独使用或与阿奇霉素协同作用都对鸡肉有良好的抑菌效果，可有效延长鸡肉货架期2～4 d，并且二者共同作用时对鸡肉的保鲜效果更好．王鹏等[13]选取新鲜猪肉作为研究对象，分别用浓缩的戊糖乳杆菌菌悬液及其发酵上清液对鲜猪肉进行处理，结果表明，经上清液处理的猪肉中的细菌菌落总数始终比对照组低，证明戊糖乳杆菌的上清液有良好的抑菌保鲜作用，此结果与本文研究结果相似．

2．2 pH

pH常被作为评价肉类新鲜度的指标之一[14]．根据GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品》，将鸡肉分为3个等级(一级鲜度为pH 5．8～6．3；
二级鲜度为pH 6．3～6．7，第三个等级腐败变质肉为pH > 6．7)．

图2表示不同处理组鸡肉样品在4 ℃贮藏条件下pH变化情况．由图可知，pH整体变化呈“V”型．由图2(a)可知，第2 d时，4组样品的pH下降到最低值，这可能是初始鲜肉冷却排酸过程不充分造成[15-16]；
第4 d时，对照组A-NC、A-PC已变质，处理组A-T1和A-T2属于次鲜肉；
第8 d时，所用样品pH均超过6．7，属于腐败变质肉；
在贮藏后期10 d时，处理组A-T1相比于阴性对照组pH降低了 6．19%；
而处理组A-T2与阳性对照组比较后，下降了5．90%．结果表明细菌素粗提物可减缓鸡肉贮藏过程中pH的上升．

根据图2(b)，在第2 d时，所有样品的pH均属于一级鲜度；
样品保存第4 d，对照组B-NC、B-PC发生变质，处理组B-H1处于二级鲜度范围，而处理组B-T2的pH仍在5．8～6．3，属于一级鲜度；
第6 d时，处理组B-H2未超过6．7，而另外3组样品则腐败变质；
第8 d时，所有样品均成为变质肉．贮藏后期第 10 d，和阴性对照组B-NC进行相比，处理组B-H1与处理组B-H2的pH分别降低了6．04%、10．06%(P< 0．05)，两组对照组B-PC与B-NC的pH无显著性差异．结果表明细菌素粗提物与阿奇霉素共同处理可减缓鸡肉pH的上升．

(a)细菌素粗提物单独处理

(b)细菌素粗提物与阿奇霉素共同处理

通过样品pH变化情况发现，样品pH变化结果与细菌落总数变化情况具有一致性，说明细菌素粗提物单独使用或与阿奇霉素共同使用可通过抑制微生物的生长，来延缓鸡肉pH的变化．崔天琦等[17]研究发现，在加入L．plantarumJY-22细菌素粗提物可以造成鲢鱼丸在储藏的时间内减缓pH值的下降速率，而本文与其研究结果相似．

2．3 TVB-N

挥发性盐基氮(Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N)作为评判动物性食品新鲜程度的重要指标而出现[18]．肉及肉制品中TVB-N的标准：一级鲜肉≤15 mg/100 g；
二级鲜肉≤20 mg/100 g；
变质肉 > 20 mg/100 g[19]．图3表示不同处理组的样品贮藏期间TVB-N变化情况，当贮藏时间的增加，处理组和对照组样品的TVB-N值均呈现上升趋势．图3(a)中，初始时样品TVB-N值均小于10 mg/100 g，为一级鲜度；
第4 d时，对照组A-PC高于20 mg/100 g，属于变质肉；
而对照组A-NC，处理组A-T1和A-T2均低于 15 mg/100 g，为一级鲜度；
第8 d时，对照组均为变质肉，处理组A-T1，A-T2则处于二级鲜度状态；
贮藏后期10 d时，处理组A-T1与阴性对照组相比降低了32．00%，处理组A-T2与阳性对照组相比降低了 30．13%．结果表明，细菌素粗提物可有效减缓鸡肉贮藏过程中TVB-N值的增加．

图3(b)中，第4 d时阴性和阳性对照组TVB-N值大于20 mg/100 g，处理组B-H1和B-H2的TVB-N值分别为13．58 mg/100 g、12．11 mg/100 g，均为一级鲜度；
第8 d时，对照组A-NC，A-PC均为变质肉，而处理组B-H1、处理组B-H2则处于二级鲜度状态；
贮藏末期第10 d，处理组B-H1和B-H2与阳性对照组相比TVB-N值分别降低了31．40%、39．38%(P< 0．05)，阴性对照组与阳性对照组无显著性差异．因此细菌素粗提物与阿奇霉素的共同作用能有效减缓鸡肉TVB-N值的上升．

(a)细菌素粗提物单独处理

(b)细菌素粗提物与阿奇霉素共同处理

由样品TVB-N值变化情况可知，在第8 d，测得对照组A-NC，A-PC的TVB-N值均超过20 mg/100 g，处理组的TVB-N值小于20 mg/100 g，属于二级鲜肉，该变化与前文菌落总数变化趋势基本一致．说明细菌素粗提物单独使用或与阿奇霉素共同使用可通过抑制微生物的生长，有效减缓鸡肉TVB-N值上升．卜坚珍等[20]利用乳酸链球菌素(0．12%)分别与山竹多酚(0．4%)和茶多酚(0．4%)复配抑菌液处理新鲜鸡胸肉，贮藏末期(第9 d)处理组的鸡胸肉TVB-N值小于20 mg/100 g，为二级鲜度；
而对照组鸡肉TVB-N值为27．82 mg/100 g，属于变质肉，本文与其研究结果相似．

2．4 肉的持水力

鸡肉及鸡肉制品的持水力是判定其品质的重要指标之一[21]．4 ℃条件下，不同方法处理的鸡肉样品连续贮藏10 d持水力变化如图4所示，在第0 d，所有样品的持水力处于60%～80%．处理组持水力始终显著高于对照组，可能是由于细菌素本身具有较好的持水力[22]，导致其初始值高于对照组．

如图4(a)所示，四组样品中，鸡肉样品持水力随着贮藏时间的延长而逐渐地降低，但是处理组持水力降低速率显著低于对照组(P< 0．05)．贮藏末期10 d，与0 d相比，处理组AT1持水力值下降约40%，处理组AT2持水力值下降低约30%；
而阴性对照组下降约50%，阳性对照组下降约45%，均明显高于对照组的下降速率，表明植物乳杆菌XCT1-1粗提物能有效减缓鸡肉持水力的下降．

图4(b)中，阴性对照组与阳性对照组无显著性差异(P> 0．05)，与阴性对照组相比，贮藏末期处理组B-H1和B-H2的持水力降低速率减缓了10．87%、28．87%(P< 0．05)．结果表明植物乳杆菌XCT1-1粗提物与阿奇霉素共同作用可有效减缓贮藏鸡肉持水力的下降．

(a)细菌素粗提物单独处理

(b)细菌素粗提物与阿奇霉素共同处理

根据样品持水力变化情况分析：添加细菌素粗提物及其与阿奇霉素共同作用能有效减缓鸡肉持水力下降，且二者共同作用效果更佳．邱爽等[22]发现细菌素bifidocinA可有效减缓鸡肉持水力的下降速率，在贮藏期第28 d，添加细菌素bifidocin A的持水力均为70%，而对照组的持水力低于68%，此研究结果与本研究结果相似．

本文通过测定鸡肉中细菌菌落总数、pH、TVB-N、持水力等指标，验证了植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物和阿奇霉素对鸡肉中耐药性E．coli的抑制作用．结果表明，在4 ℃贮藏过程中，经细菌素粗提物单独处理或其与阿奇霉素共同处理感染耐阿奇霉素的E．coli鸡肉，可有效抑制鸡肉中E．coli以及其他细菌的生长繁殖，有效减缓鸡肉的pH值、TVB-N值、持水力值的上升，且植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物和阿奇霉素共同处理组抑菌效果更好，可延长细菌菌落总数超标时长至少4 d．植物乳杆菌XCT1-1粗提物可以作为生物抗菌剂用于鸡肉及类似产品的冷藏保鲜中，具有良好的应用前景．