江鳕生化遗传学特性及群体遗传结构初步分析

张林,甘金华,何力,张涛,周剑光

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心，湖北 武汉 430072)

近年来，水产养殖在很大程度上是依靠消耗大量生产要素资源、自然资源来维持的，造成渔业资源衰退。面对种质资源遭受到的威胁，我们对中国大部分鱼类的种质情况尚不明了。种质鉴定能反映鱼类种群资源状况，查明种群的遗传结构和变异情况，确定原种保护和开发利用措施[1]。

江鳕(LotaLota)，又名鲇鱼、山鲶鱼、山怀子，属于鳕形目，鳕鱼科，江鳕属(Lota)，鳕科鱼类中唯一的淡水鱼种。该鱼种属北极淡水复合体鱼种，是典型的冷水性鱼类，具有酷寒期于冰下生殖洄游，并在水温接近 0 ℃时产卵的特殊习性。该鱼种广泛分布在北美和欧亚的一些内陆水域和海湾，属于高纬度水域珍贵经济鱼类，因具有肥大的肝脏和美味的雄性精巢而著称[2]。中国仅新疆的额尔齐斯河、东北的黑龙江水系及鸭绿江上游水域有该鱼种的分布。该鱼种可作为防冻、抗寒及低温状态下生命活动等方面研究的特定物种。

目前关于该鱼种相关的研究很少，仅见黑龙江水系及鸭绿江上游的江鳕生物学方面的报道，包括江鳕对环境的适应性、影响江鳕徊游的因素、年龄、生长、食性、繁殖、形态学及亚种的分类[3-6]，江鳕作为野生鱼种常被用来研究环境污染状况的指标。对额尔齐斯河水域江鳕的研究非常少，更未对江鳕进行系统的种质研究和种质标准的制定。近年随着江鳕捕获量的增加，野外水域中该鱼种越来越少，因此对该鱼种的种质资源开展生化遗传学、分子生物方面的系统研究，对该鱼种的开发利用以及资源保护具有非常重要的意义。本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶4种同工酶在江鳕的肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏和眼睛等6 种组织中的分布、活性及遗传变异进行了比较分析，旨在了解4种同工酶在江鳕6种不同组织中的差异性表达，解析江鳕额尔齐斯河群体的遗传学结构，为该鱼种野生种质资源保护及江鳕属鱼类的分类、物种鉴定和系统进化研究提供理论依据。

1.1 试验动物

试验动物江鳕30尾(雌雄各15 尾)，由浙江海洋大学于2017年 7月采自新疆额尔齐斯河水系的布尔津河流域，样品体长在 20.3～22.5 cm 之间，体重为 230～246 g，江鳕经充氧活体送至实验室养殖，暂养于室内2.0×2.0×1.8 m循环水鱼池中一周后开始实验。

1.2 样品采集及样本制备

样品采集：将鱼池中的10尾鱼(雌雄各5尾)搬运至实验室，剪鳃放血处死，将鱼体表面水分擦干后解剖，分别取背部肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏和眼睛等6种组织，编号后放入相应的塑料袋，于-80 ℃低温冰箱保存备用。

样本制备：取0.3～0.5 g冷冻组织样品，使用生理盐水将血液清洗干净，剔除表面的杂质，按1∶3的比例(m/v)加入新鲜灭菌蒸馏水，于干净的匀浆器中充分匀浆后以12 000 r/min低温离心30 min分离上清，将上清液转入新离心管中，重复 2～3次，直至上清液澄清为止，整个操作过程需在低温下进行。

1.3 同工酶的凝胶电泳分析

同工酶采用聚丙烯酰胺(PAGE)梯度凝胶电泳分析。聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳方法参照Nei等[8]的报道，并加以改进。聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳所采用4.0%的浓缩胶和7.0%的分离胶，电泳时采用pH 8.3的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，加样前，先用50 mA电流进行30 min恒流预电泳以除去胶中杂质，然后向每个加样孔中加入20 μL制备好的样品，用280 mV电压进行约10 min电泳，待样品出凝胶孔后，将电压调至220 mV进行电泳，待上样溴酚蓝指示剂电泳至平板底处时，结束电泳，整个电泳过程均在4 ℃下进行。

1.4 凝胶的染色和脱色

电泳结束后，将胶片从玻璃板中剥离，放入37 ℃恒温箱中预热的染色液进行染色，染色至所有条带清晰时终止。各种同工酶的染色过程参照Shaklee和Nei等[7-8]的报道。染色好的胶片放入2.5%冰乙酸中进行脱色，脱色后清晰显示的胶片，放入保存液中进行固定。

1.5 图谱分析与数据处理

固定好的凝胶照片用凝胶成像系统(Bio-RAD Gel DOCTMXR+)进行拍照并分析，并用专用水溶性玻璃纸将胶片固定在玻璃板上，置于阴凉处晾干，以利于长期保存。电泳图谱中各种同工酶的缩写、命名、编号、酶谱分析、基因位点、等位基因和基因型的命名参照Nei和Hofmann等的报道[8-9]。基因位点的命名以向阳极迁移的速度快慢，采用数字依次编号。依据电泳结果判断每种同工酶的基因型，根据基因型计算每个等位基因的基因频率。采用多态位点比例和平均杂合度2个指标来衡量遗传变异的程度。平均杂合度、多态位点比例、遗传距离等参数的计算参照Nei[8]和日本水产资源保护协会报道的方法[9-10]，即实测等位基因的出现频率小于或等于0.99时，可视为多态。参照杨元吴[11]的方法对数据进行统计处理。

2.1 江鳕同工酶的组织特异性表达

2.1.1 乳酸脱氢酶的组织差异性表达

乳酸脱氢酶为四聚体酶，在江鳕中由 5个基因位点编码，5个基因位点均为多态。在眼睛中出现5条酶带，多态性明显。LDH1在脾脏、肾脏中不表达，在其他组织中微弱表达，LDH1条带在肌肉中的颜色最深，活性最强；
LDH2在肝脏中不表达，在其他5个组织中均有分布；
LDH3在各组织中均有表达，条带清晰，在肝脏中表达较弱，其余组织中表达均较强，LDH2、LDH3在心脏中的颜色最深，活性最强；
LDH4、LDH5仅在肝脏及眼中有表达。江鳕LDH 同工酶的电泳结果见图1。

图1 江鳕LDH同工酶的电泳图谱1-3：肌肉，4-6：肝脏，7-9：心脏，10-12：脾脏，13-15：肾脏，16-18：眼睛。下同。Fig.1 Electrophoretograms for LDH isozyme of Lota lota1-3:muscle, 4-6:liver, 7-9:heart, 10-12:spleen, 13-15:kidney,16-18:eye.The same below.

2.1.2 乙醇脱氢酶的组织差异性表达

乙醇脱氢酶是一个分子量为80 kDa的二聚体，主要催化乙醇转化为乙醛。江鳕的 ADH由5个基因位点编码，ADH1、ADH2、ADH3为多态，ADH4和ADH5为单态。ADH1仅在肝脏和肾脏中表达，ADH2在肌肉、肝脏和肾脏中表达，ADH3在心脏中表达最丰富，在肌肉和肝脏中无表达，在其他组织中有微弱表达，ADH4除在肝脏中表达较弱，在其他组织中活性均较强，其中心脏与眼中活性最高，ADH5仅在肝脏、眼中有微弱的表达。江鳕ADH 同工酶的电泳结果见图2。

图2 江鳕 ADH同工酶的电泳图谱Fig.2 Electrophoretograms for ADH isozyme of Lota lota

2.1.3 苹果酸脱氢酶的组织差异性表达

苹果酸脱氢酶为二聚体酶，包括上清液型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH)两种形态，二者不能相互转化形成异二聚体。江鳕的MDH由两个基因位点编码，均为多态，MDH-1在除脾脏外其他组织均可检测到，MDH2在所检测的组织中均可检测到。江鳕MDH同工酶的电泳结果见图3。

图3 江鳕MDH同工酶的电泳图谱Fig.3 Electrophoretograms for MDH isozyme of Lota lota

2.2 江鳕群体遗传结构参数

通过分析江鳕的肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏和眼睛等6种不同组织中的LDH、ADH和MDH等3种同工酶代表性条带，初步了解了江鳕群体遗传学参数(表1)。经统计共记录基因位点12个，10个基因位点有多态，多态位点的基因频率为0.125～0.875，多态位点比例为83.33%；
等位基因数为22，位点平均有效等位基因数为1.833 3；
平均观测杂合度为0.423 4，平均期望杂合度为0.310 9，Hardy-Weinberg 遗传偏离指数 D为0.361 9。

表1 江鳕群体的遗传学结构Tab.1 Genetic structure of Lota lota

续表1,Tab.1 Continued

2.3 江鳕生化遗传学标记

首先随机取5尾鱼，进行6种组织常见同工酶(LDH、ADH、MDH、EST、IDHP)筛查，然后取10尾健康江鳕对筛选的单态同工酶进行验证，以初步确定反映江鳕种质的生化遗传特性。结果表明：江鳕肌肉组织异柠檬酸脱氢酶(IDHP)是单态，且稳定表达，可作为江鳕生化遗传学标记。江鳕肌肉组织IDHP电泳结果见图4。

图4 江鳕肌肉组织IDHP电泳图谱1-10泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.4 Electrophoretogram of IDHP isozyme expressed in muscle of Lota lota1-10 showed the zymograms of different individuals.

3.1 江鳕同工酶表达的组织特异性分析

通过对江鳕的肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏和眼睛6种组织的LDH、ADH、MDH、EST、IDHP 5种同工酶进行电泳分析，发现同工酶表达具有显著的组织特异性。因江鳕许多组织及个体酯酶多次未能检出，因此本研究仅选择LDH、ADH和MDH 3种经典的同工酶酶谱初步分析江鳕的遗传学结构。研究发现LDH、ADH、MDH 3种同工酶在心脏中均有高水平进行表达，其次是眼睛、肝脏、肌肉，肾脏和脾脏中各同工酶的表达逐渐减弱，多态水平高。同时对多种组织进行IDHP电泳，发现只有肌肉组织是单态，表达1条酶带，可以作为江鳕特有的种质生化遗传标记。而其他组织IDHP表达不清晰，拖带严重。

LDH一般由A和B两种不同多肽链组成的同源或异源四聚体。本研究中LDH1由A基因编码形成四聚体，基本上在无氧条件下起作用，这说明江鳕肌肉无氧代谢较为旺盛，与其作为冷水底栖凶猛肉食鱼类的习性相适应[12-13]。LDH3由B基因编码形成四聚体，在有氧组织中表现出很高的活性，这与心脏催化乳酸氧化形成丙酮酸进入三羧酸循环相一致。在心脏中的LDH3、ADH3、ADH4 和 MDH2特异性高表达，进一步说明了心脏无可替代的代谢功能。江鳕LDH的组织分布证明了江鳕很可能存在编码 LDH-C的基因。已有研究表明，LDH-C的四聚体仅在哺乳动物的精子以及高等鱼类的肝和眼中检测到[14-16]。本研究中发现江鳕眼睛的LDH同工酶有5条特异性多态条带，说明由LDH-C基因编码，与已报道的研究结论相符，该结果也表明江鳕在进化上处于相对高级的阶段。分析原因可能是江鳕在淡水环境中处于食物链顶端，所面临的选择压力较大，因此其进化速度相比其他高等鱼类更为快捷。

3.2 江鳕群体的遗传结构分析

种群的遗传结构能够反映物种的进化过程，多态位点比例(P)和平均杂合度(H)指标是衡量鱼类群体生化遗传变异和种质资源状况的重要指标[15-18]。多态位点比例会因鱼种或同种鱼的不同种群而出现差异，本研究中得到的 P 值及 He均较高，表明江鳕额尔齐斯群体在生化遗传变异上也处于较高水平，当然也可能由于本研究所选代表性酶种类较少，其次IDHP、EST各组织中检测到杂合子的情况较少或未检出。因此，如果多种酶进行综合考虑，其P值和He值可能较本研究中常见的有代表性的3种酶谱所得出的数据小些，但即使这样，额尔齐斯河江鳕群体的遗传变异性高于鱼类的平均水平。

遗传偏离指数(D) 也是全面反映群体的遗传平衡状况的重要指标。D值接近零则基因的分布就接近平衡状态，D值的正负反映了种群内杂合子的过剩或缺失状态，D值为正表明杂合子过剩，为负表明杂合子缺失[17]。本研究中江鳕群体的D值为0.361 9，表明其杂合子过剩，说明江鳕群体遗传变异程度较大，遗传多样性较高。同时江鳕群体的有效等位基因数Ne为1.833 3，这比报道的硬骨鱼类的多样性的有效等位基因数(Ne=1.16～1.58)[18]的上限略高，可能与本研究中同工酶样本数量不多有关。额尔齐斯河江鳕群体的种质资源库具有较大的变异程度，因此额尔齐斯河江鳕可为后续的人工育种提供良好的亲本。

同时本研究通过对江鳕6种主要组织的同工酶凝胶电泳图谱分析，初步确定了IDHP在肌肉组织中的表达量高且活性稳定，因此异柠檬酸脱氢酶可作为江鳕鉴定的生化遗传标记。

该研究通过对江鳕多种同工酶在不同组织中的差异表达分析，有利于从生化遗传的角度判定江鳕与其他属鱼类亲缘关系的远近，同时也可为江鳕种质标准的建立及良种选育提供理论依据。