miR-22,调控PI3K/AKT,信号通路对肝癌大鼠的影响

金 丹 金剑英 郭群依 高娅芬 林 红 杜学峰 谢静静

1.浙江省台州医院血液肿瘤内科，浙江台州 317000；
2.浙江省台州医院肝胆外科，浙江台州 317000

肝癌患者每年的病死率较高，其主要原因为肝癌起病隐匿，确诊时就已丧失最佳外科手术切除的机会，因此手术治疗效果不佳，发展分子靶向治疗是目前的治疗目标。近年来，miRNA 已被证实是多种疾病的有效生物标志物，其在肝癌中的潜在价值也一直被挖掘。研究认为，miRNA 参与癌细胞的发育与分化，转录后能够水平上调靶基因的表达。研究表明，miR–22 在肝癌细胞及组织中高表达，说明miR–22 参与肝癌的发生、发展，且miR–22 的异常表达对肝癌的诊断也存在一定的意义。磷脂酰肌醇–3 激酶（phosphatidylinositol 3–kinase，PI3K）参与增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节。研究表明，P13K 和其下游A 蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）所组成的信号通路参与肿瘤的发生与发展，并对该通路进行调节，进而对细胞的存活及增殖造成影响。因此，本研究旨在通过下调miR–22 以调控PI3K/AKT 信号通路，观察其对肝癌大鼠的干预效果。

1.1 研究动物

43 只SPF 级健康雄性SD 大鼠，体重100～120g，平均（110.23±8.42）g；
鼠龄6～8 周，平均（7.25±1.25）周，购自西安交通大学医学部实验动物中心[许可证号：SCXK（陕）2012–003]。所有大鼠均于陕西中医药大学实验中心分笼饲养，喂食标准大鼠饲料，自由摄入食水，室温（23±2）℃，相对湿度（50±5）%，12h 明暗交替。适应性饲养1周后进入实验。本研究经浙江省台州医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：tzy–2020166）。

1.2 方法

1.2.1 仪器准备 离心机（KH20R–Ⅱ，张家港市骏宇离心机制造有限公司）；
全自动生化检测仪（BK–400，山东博科生物产业有限公司）；
miRNA提取分离试剂盒（武汉时胜生物科技有限公司）；
蛋白印迹试剂盒（上海羽哚生物科技有限公司）。

1.2.2 肝癌大鼠建模按照完全随机分组法选取10 只大鼠作为空白组，余33 只进行建模。从传代Wistar 大鼠腹腔抽取癌性腹水5ml，离心半径10cm，2000 转/min 离心2min，制成半液态癌性腹水，放入1ml 注射器内备用。于大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300mg/kg）进行麻醉后切开腹部，暴露腹腔，取离体表最近的肝叶进行肿瘤种植。用手指按压肝叶减少呼吸，注射提前配置好的半液态癌性腹水，注射量0.05ml。注射完毕后，用棉签在穿刺点位置按压3min，观察有无活动性出血，轻轻将肝脏还纳腹腔，逐层关腹。

1.2.3 分组及干预 最终成功建模30 只，按照完全随机分组法将其分为模型组、上调miR–22 组、下调miR–22 组，每组各10 只。通过Lipofectamine 2000将400nm miR–22 inhibitor 转染到上调miR–22 组、200nm miR–22 inhibitor 转染到下调miR–22 组，6h 后将其放入10% Dulbecco 的改良Eagle 培养基（Dulbecco"s modified of Eagle medium，DMEM），置于37℃的CO培养箱中孵育48h，最后使用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real–time polymerase chain reaction，qRT–PCR）法对miR–22 inhibitor 转染效果进行检测。模型组、空白组大鼠均给予等体积的0.9%氯化钠溶液干预。各组均连续干预2 周。

1.3 观察指标

1.3.1 qRT–PCR 法检测miR–22 相对表达量 取出各组大鼠肝组织，经12000 转/min 离心15min，得到标本提取液，其余步骤严格按miRNA 提取分离试剂盒说明书进行。提取细胞总RNA 后，经逆转录获取cDNA，使用Primer5.0 软件设计引物，以U6 作为内参基因。引物序列如下：miR–22 上游引物：5′–GCACATGCGAATAAGCTGCCAGTTGAAGAA–3′，下游引物：5′–GACGACCCAGTTATCAGTCCGTTT GGAA–3′；
U6 上游引物：5′–GGCCTCTCGAACTTG CGTGTC–3′，下游引物：5′–CCATCGGAAGCTCGTA TACGA–3′。采用2方法计算miR–22 相对表达量。检测3 次，取平均值。

1.3.2 检测指标 采集大鼠腹主动脉血3ml，2000 转/min 离心5min（离心半径5cm），采用BK–400 全自动生化检测仪检测谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）。

1.3.3 病理组织观察 用安乐法处死两组大鼠后取大鼠的肝组织，并对其进行肉眼观察，对肝脏病变较为明显（结节大的）的部位进行切取，然后平均分为2 份，将其中一份置于10%的福尔马林溶液中，然后对其进行苏木精–伊红染色，使用显微镜对肝组织的形态进一步观察分析；
其中10%～20%为少量，30%～60%为部分，70%～80%为多数；
另一份置于–80℃的冰箱中保存备用。

1.3.4 采用蛋白质印迹（Western blotting）法检测PI3K、AKT、p–AKT 含量 对标本提取液进行1000转/min 离心处理，离心半径5cm，离心5min 后对沉淀物进行提取，并将放射免疫沉淀试验（radio immunoprecipitation test，RIPA）裂解缓冲液添加到沉淀物中，对其在–80℃与40℃的环境中进行反复冻融后，离心半径5cm，1000 转/min 离心5min，提取上清液，其余步骤严格按照试剂盒说明书进行，结果采用LabWorks3.0 软件以目的条带β–actin 的灰度值进行分析，重复实验5 次，取平均值。

1.4 统计学方法

2.1 各组miR–22 相对表达量比较

与上调miR–22 组比较，模型组、下调miR–22组大鼠的miR–22 相对表达量较低，且下调miR–22组幅度变化最大，差异均具有统计学意义（＜0.05），见表1。

表1 各组miR–22 相对表达量比较（）

2.2 各组肝功能指标比较

与上调miR–22 组比较，模型组、下调miR–22组大鼠的TBIL、ALT、ALB 水平表达较低，且下调miR–22 组幅度变化最大，差异均具有统计学意义（＜0.05），见表2。

表2 各组肝功能指标比较（）

2.3 各组病理组织观察

空白组大鼠肝组织正常，肝组织结构清楚，无异样血管出现；
下调miR–22 组大鼠肝组织异常，肝组织结构稍微模糊，少量异样血管出现；
模型组大鼠肝组织异常，肝组织结构模糊，部分异样血管出现；
上调miR–22 组大鼠肝组织异常，肝组织结构模糊，多数异样血管出现，见图1。

图1 各组大鼠病理组织观察（苏木精–伊红染色×200）

2.4 各组大鼠的PI3K、AKT、p–AKT 相对表达量比较

与上调miR–22 组比较，模型组、下调miR–22组大鼠的PI3K、AKT 水平较低，p–AKT 水平较高，且下调miR–22 组幅度变化最大，差异均具有统计学意义（＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠的PI3K、AKT、p–AKT 相对表达量比较（）

图2 各组大鼠的p–AKT、PI3K、AKT 表达水平比较（Western blotting 条带图）

肝癌会出现肝内散播现象，目前针对肝癌患者需要一个有效、安全且方便的治疗方法。随着对肿瘤的研究，逐渐开辟一种新型的通过调控信号通路及重要的靶分子治疗肝癌的途径，其主要机制为通过对肝癌分子的改变，从而达到良好的治疗效果。

microRNA（miRNA）是一类具有调控功能的非编码内源性小分子RNA。研究证实，miRNA 在肝癌中具有重要作用，并参与肝癌的发生、发展。随着对miRNA 的深入研究，发现它可调节多个原癌基因和抑癌基因的表达，还可影响肿瘤的发生、发展及其预后。本研究结果显示，在肝癌组织中，下调miR–22 可降低TBIL、ALT、ALB 水平，从而对肝癌的发生、发展产生一定的影响作用。分析原因：miR–22 可通过调控靶向基因从而实现激活肝癌细胞的效果，同时该因子作为肝癌上皮–间质转化过程的启动子，可以靶向植入同结构域蛋白来转移肝癌细胞，加重肝癌患者的病情。

抑制AKT 活化，促进p–AKT 表达，可抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡，抑制肿瘤的进程，表明AKT 活化与细胞的增殖、迁移、侵袭均有关。研究证实PI3K/AKT 是调节细胞分化、增殖、凋亡和衰老的关键信号通路。本研究结果显示，下调miR–22 的表达可使PI3K、AKT 水平降低，p–AKT水平升高。分析原因：p–AKT 参与多种肿瘤的发生、发展，可抑制细胞周期进程，是PI3K/AKT 信号通路的主要细胞周期调控因子，能够促进细胞凋亡。下调miR–22 可有效抑制AKT 的活性，通过去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇，从而激活PI3K/AKT 信号通路，引起一系列反应促进细胞凋亡。本研究显示下调miR–22 可减少PI3K、AKT、p–AKT 在癌细胞中的表达水平。

综上所述，通过下调miR–22 调控PI3K/AKT 信号通路可使大鼠的肝功能得到有效改善，为临床肝癌靶向治疗提供一定的理论依据，但本研究样本数较少，且未对其关联性进行深入研究，仍需多中心大样本研究进行证实。