脂肪干细胞源性外泌体对瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响

林正杰 江诗海 梁堂钊 任建华 何容涵 胡瑛 王昆 朱蕾

增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质堆积为主要特征的一类病理性愈合方式，在临床上表现为创面边缘高出皮肤表面、早期充血明显、可伴有疼痛或瘙痒，可能会引起关节等活动障碍，对患者的生活和心理造成一系列不良影响。目前，临床上主要采用激光、皮下注射糖皮质激素等非手术治疗方法，但这些治疗手段都无法有效地治疗增生性瘢痕。同时，增生性瘢痕采用单纯手术切除复发率较高，不推荐单独应用。因此，探索一种新的增生性瘢痕的治疗方案成为当前迫切需求。

脂肪干细胞（ADSC）被用于治疗纤维化，其来源较为丰富，获取途径多样，被广泛用于研究。ADSC 源 性 外 泌 体（ADSC-Exos）由ADSC分泌，目前研究表明，ADSC-Exos 在创面愈合、瘢痕预防等方面发挥着重要作用。同 时，ADSCExos 能够有效逆转心脏、肝脏、肾脏等的纤维化，为纤维化的治疗提供新的方向。近年来，有关ADSC-Exos 在增生性瘢痕中作用的研究与日俱增，本课题组通过制备ADSC-Exos 处理瘢痕成纤维细胞，探索ADSC-Exos 对瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响，为后期ADSC-Exos 体内实验研究奠定坚实的基础，以期为将ADSC-Exos 用于治疗增生性瘢痕提供坚实的理论基础。

一、细胞来源及主要试剂

ADSC、瘢痕成纤维细胞、细胞培养板、培养瓶购自康宁公司，DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液购自美国Gibco 公司。CCK-8 试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。Ⅰ型胶原（COL1）、COL3 抗体、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体购自美国Abcam 公司。TRIzol RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量（qRT）-PCR 试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

二、细胞培养

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基（含100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素）培养人瘢痕成纤维细胞；
置于37 ℃含5% CO的环境中培养，2～3 d 传代1 次，当细胞生长至体积达80%～90%时，利用含0.25%胰酶进行常规传代。本研究采用第3 代ADSC 所提取的ADSC-Exos 进行实验。

三、ADSC-Exos 对瘢痕成纤维细胞活性与增殖影响的评估

1. ADSC-Exos 的制备

将5×10的ADSC（第3 代）接种于培养瓶中，待24 h 细胞贴壁后，采用含无外泌体血清的低糖DMEM 培养基饥饿培养48 h，并收集其培养上清，300×g、4℃离心10 min，2000×g、4℃离心20 min，10 000×g、4 ℃离心30 min 后，将上清通过针筒式滤膜过滤器（0.22 µm）过滤，再行100 000×g、4 ℃离心70 min 2 次后，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，并通过透射电镜、粒径、蛋白免疫印迹法检测ADSC-Exos。

2. CCK-8 实验

将3×10个/孔的瘢痕成纤维细胞接种于96孔板中，设置对照组、ADSC-Exos 组，每组设置5 个重复实验孔，加入等量的PBS、ADSC-Exos 培养，分别于0、12、24、48 h 后通过CCK-8 试剂盒对瘢痕成纤维细胞的增殖进行测定，对各组增殖率进行统计学分析。

3.蛋白免疫印迹法

将瘢痕成纤维细胞接种于6 孔板，然后用ADSC-Exos 处理48 h。对照组细胞培养时间与ADSC-Exos 组相同但不作任何处理。48 h 后用PBS 清洗细胞3 次，然后加入裂解液收集蛋白质，10 000×g 离 心15 min。采 用SDS-PAGE 凝 胶 电泳，用12.5%的分离胶分离蛋白质，在SDS-PAGE凝胶上电泳，然后将其转移到PVDF 膜上。将膜用5% 脱脂牛奶密封1 h，然后与COL1、COL3、α-SMA 等抗体于4 ℃孵育过夜，样品用TBST 缓冲液洗涤3 次，用二抗孵育1 h，再用TBST 缓冲液洗去二抗，使用化学发光成像仪成像。每个条带的灰度值经Image J 软件分析。

4. qRT-PCR

分析ADSC-Exos 对瘢痕成纤维细胞纤维化相关指标的影响，将对照组与ADSC-Exos 组处理的瘢痕成纤维细胞依据试剂盒说明书提取细胞总RNA，利用qRT-PCR 检测纤维化相关指标COL1、COL3、α-SMA 的 表 达，并 通 过2法进行分析，评价经ADSC-Exos 处理后纤维化指标的变化。实验至少重复3 次。实验中所涉及的基因对应的引物序列如下，内参GAPDH， forward：5′-GGAGCGCTACCCCTCCAAAAT-3′and reverse：5′-GGCTGCGTTCATACTTCTCATGG-3′；
COL1，forward：5′-GTGCGATGACACGATCTGTGA-3′and reverse：5′-CGGTGGTAACTTGGTCGGT-3′；
COL3，forward：5′-GCCAAATATGTCGTAGTGACTCA-3′and reverse：5′-GGGCGAGTACCTCCAGTTG-3′；
ɑ-SMA， forward：5′-GGCATTCGCAAGACCACCT AC-3′ and reverse：
5′-CGACATGACGTTCATGG CATAC-3′。

四、统计学处理

采用 SPSS 25.0 进行统计分析，使用 GraphPad Prism 8.0.2 进行作图。3 组数据比较采用重复测量资料的方差分析。P < 0.05 为差异有统计学意义。

一、ADSC、瘢痕成纤维细胞和ADSC-Exos的鉴定

CD90、CD13、CD105、CD44 表 达 阳 性，CD34、CD45 表达阴性，表明该细胞为ADSC（图1A）。瘢痕成纤维细胞Vimentin 表达阳性，对照为阴性（图1B）。透射电镜结果表明，ADSCExos 为典型的杯状囊泡（图1C）。粒径分析表明，ADSC-Exos 的平均直径为30～150 nm，浓度约为1.36×10个/mL（图1D）。蛋白免疫印迹显示，ADSC-Exos 中CD81、CD63 表 达 阳 性，Calneix 表达阴性（图1E）。这些数据表明本研究成功分离了ADSC-Exos。

图1 ADSC、瘢痕成纤维细胞和ADSC-Exos 的鉴定

二、ADSC-Exos 对瘢痕成纤维细胞增殖和纤维化的影响

将ADSC-Exos 与瘢痕成纤维细胞共培养，结果显示ADSC-Exos 组的瘢痕成纤维细胞增长缓慢（图2A）。增殖实验显示，经ADSC-Exos 处理的瘢痕成纤维细胞增殖率逐渐降低（n = 5，P = 0.017），表明ADSC-Exos 可以抑制瘢痕成纤维细胞的增殖（图2B）。此外，ADSC-Exos 还能下调COL1、COL3 和α-SMA 的 表 达（图2C、D）。人COL1、COL3 和α-SMA 的mRNA 表 达 经ADSC-Exos 作用后下调（n = 5，t = 0.670，P = 0.029），表明ADSC-Exos 可以逆转瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，从而减轻瘢痕的纤维化（图2E）。以上结果证实，ADSC-Exos 可以抑制瘢痕成纤维细胞的生物学功能。

图2 ADSC-Exos 对瘢痕成纤维细胞增殖和纤维化的影响

ADSC 是典型的低分化多能干细胞之一，具有较低的免疫原性，来源丰富。ADSC-Exos 由ADSC分泌，其在创面愈合、预防瘢痕等方面具有重要作用。外泌体从细胞中释放，参与多个生物学和病理学过程。由于具有携带mRNA、蛋白质、微RNA、长链非编码RNA 的能力，外泌体作为细胞信号转导因子的作用已在许多研究领域中得到确认，其所携带的RNA 和蛋白质已被证实在创面愈合中起重要的作用。外泌体在增殖、迁移过程中的作用也有相关的研究。ADSC-Exos 在皮肤创伤愈合中的应用已取得显著进展。ADSC-Exos 治疗增生性瘢痕的应用前景广阔。

ADSC-Exos 抗纤维化的作用还在肝脏、肾脏及心肌纤维化等方面得到验证。所以本研究提取ADSC 的培养上清，制备ADSC-Exos，初步探讨ADSC-Exos 对瘢痕成纤维细胞的影响。结果显示，在ADSC-Exos 的作用下，瘢痕成纤维细胞的增殖和纤维化指标受到影响，这为ADSC-Exos 在增生性瘢痕的治疗提供了可靠的实验证据。同时，在增生性瘢痕的进展过程中自噬扮演着重要的角色。本研究显示，在增生性瘢痕中，ADSC-Exos能有效下调COL1、COL3、α-SMA 等的表达，从而抑制瘢痕成纤维细胞的纤维化。

综上所述，ADSC 通过旁分泌作用分泌ADSCExos，作用于瘢痕成纤维细胞，下调COL1、COL3和α-SMA 等的表达，这为ADSC-Exos 治疗增生性瘢痕提供了新思路。然而ADSC-Exos 在增生性瘢痕中的作用，仍需进一步深入探讨，以期为ADSC-Exos 对增生性瘢痕的治疗应用提供更科学的依据。