TaqMan实时荧光PCR检测菰米成分的方法建立

杨爱馥，万 超，刘雪华，梁 冰，郑秋月，姜 丽,

（1.大连海关，辽宁大连 116001；
2.大连民族大学，辽宁大连 116600）

随着现代食品营养学的发展，公众对营养问题关注的焦点已经由解决一般人群传统的营养缺乏转向如何合理膳食、平衡营养、促进健康。随着国民生活水平的不断提高，以及民众保健养生意识的增强，高营养、高价值农产品迎合了现阶段国民食物需求营养化、健康化的特点，消费量快速增长。菰米（Wild rice），也被称作野米，是禾本科菰属（）植物的颖果，属于全谷物，具有极高的营养价值，富含蛋白质、必需氨基酸、脂肪酸、维生素、膳食纤维以及各种微量元素，且脂肪含量低。此外，菰米还含有大量的活性物质，如酚酸、植物甾醇、谷维素、-氨基丁酸、类黄酮等，保证了其作为功能性食品的发展。菰米中的活性物质能够有效地抑制高脂血症和氧化应激，预防肥胖和肝脏脂肪毒性，改善异常糖代谢和抑制胰岛素抵抗、预防动脉粥样硬化、还具有抗氧化、抗炎、抗过敏和免疫调节作用。因此，菰米已得到了国内外的广泛认可，成为一种高价值的保健食品，被称为“谷物中的鱼子酱”。

世界上菰属植物有4种，包括分布在东亚的中国菰（）以及分布在北美的水生菰（）、沼生菰（s）和德克萨斯菰（）。随着菰米的商业化程度日益提高，北美菰米已作为一种营养价值高、风味独特、价格昂贵的健康食品进入饮食业并大量出口到法国、德国和意大利等国家，我国也批准了加拿大菰米的准入。这种进口的“营养之王”，正在占据国人的餐桌。但是目前尚无菰米成分检测标准和检测方法，市场上销售的菰米制品鱼龙混杂、真假难辨，因此急需开发快速、灵敏、精准的菰米成分真伪鉴别方法，以保护消费者的权益，并为菰米及其制品的进口监管提供技术支撑。

1.1 材料与仪器

广泛收集菰米样品及近源谷物、异源食用菌和动物样品，包括大米、薏米、糯米、高粱米、红米、黑米、黑麦、荞麦、苦荞、燕麦、大麦、小麦、藜麦、黄米、奇亚籽、黑芝麻、玉米、黑豆、芸豆、黄豆、绿豆、扁豆、鹰嘴豆、红豆、木耳、香菇、鳕鱼、猪肉、牛肉、鸭肉等 购自各网络平台及大连各超市；
植物基因组 DNA 提取试剂盒（货号 DP305）TIANGEN；
Premix ExTaqTM Probe qPCR（货号RR390 A） TAKARA；
合成引物、探针及测序 由华大基因完成。

QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪 ABI公司；

NanoDrop Lite 分光光度计 ThermoFisher公司；
5415R小型高速冷冻离心机 Eppendorf公司；
WNB7 7L恒温水浴锅 Memmert公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 按照TIANGEN基因组 DNA 提取试剂盒操作说明进行DNA提取；
使用超微量分光光度计进行DNA纯度及浓度的测定。

1.2.2 样品真实性鉴定 利用DNA条形码技术对收集到的菰米和近源谷物样品针对ITS基因的部分特异区段进行测序，测序结果在NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对，进行样品真实性鉴定，并选取相似度最高的结果进行系统进化树的构建。

1.2.3 引物设计 从NCBI数据库中下载中国菰（）、水生菰（）、沼生菰（）和德克萨斯菰（）及其近源种栽培稻（）、小粒野生稻（）、斑点野生稻（）、紧穗野生稻（）的 ITS 基因序列，通过Mega4比对分析，根据引物、探针差异性原则、利用软件Primer Premier 5.0设计特异性引物和探针。序列如下：上游引物：5’-CGAGAGTCGTGTGG ATGTTGT-3’；
下游引物：5’-TGCGGAAGGATCATT GTCGT-3’；
探针：FAM-5’- CGGCGGTCGGTAAGAGG TGTTCC-3’-TAMRA

1.2.4 实时荧光PCR检测方法建立 实时荧光PCR反应体系见表1。

表1 TaqMan实时荧光PCR反应体系Table 1 Reaction system for TaqMan real-time PCR

反应条件：95 ℃ 预变性 10 min（1 个循环）；
95 ℃变性 5 s，60 ℃ 退火/延伸 30 s（40 个循环），荧光阈值为设备默认值。

1.2.5 特异性试验 利用1.2.1中的DNA提取方法提取1.1中所述各样品基因组DNA，进行实时荧光PCR扩增，以ddHO水为空白对照，检测所建立实时荧光PCR方法的特异性。

1.2.6 灵敏度试验 模拟添加：分别以鳕鱼粉和易混谷物（大米、黑米和黑麦混合物）为基质做添加试验。待测物菰米样品与基质按质量比例（100%、10%、1%、0.1%、0.01%）进行混合，提取不同浓度混合样品DNA，作为灵敏度检测模板进行实时荧光PCR检测。

菰米基因组DNA梯度稀释至质量浓度为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL，进行灵敏度检测试验。

1.2.7 重复性和稳定性试验 菰米基因组DNA梯度稀释至质量浓度为10、1、0.1 ng/μL，进行实时荧光PCR检测，每个样品3个平行，以不同浓度基因组DNA获得的Ct值计算其平均数和变异系数，进行重复性和稳定性分析。

1.2.8 市售样品的检测试验 购置市售的进口菰米80份，菰米碎米5份，杂粮米10份，混合米粉5份，检测其是否含有菰米成分。

1.3 数据处理

实验设置3个平行，每组实验重复3次，结果以3次重复的平均值±标准偏差（SD）表示。利用QS6实时荧光定量 PCR 仪自带的软件分析扩增曲线和 Ct 值。利用 Microsoft Excel 2016 对实验数据进行统计分析。

2.1 样品真实性鉴定

利用DNA条形码技术对收集到的近源谷物样品进行真实性和准确性鉴定，结果如图1和表2所示。本研究收集到的样品序列和NCBI数据库比对相似度达99.9%。

表2 菰米和近源谷物样品名称及测序结果Table 2 Name and sequencing results of wild rice and near source grain samples

图1 菰米和近源谷物的分子进化树Fig.1 Evolutionary tree of wild rice and near source grain samples

2.2 真核生物18S rRNA通用引物检测结果

用真核生物18S rRNA通用引物扩增本试验所提取的所有样品DNA溶液，所有样品DNA溶液均出现扩增曲线，Ct值范围在15.26～24.85之间，说明所有用于菰米成分特异性检测的DNA样品均适用于实时荧光PCR检测（图2）。

图2 菰米和其他样品18S rRNA基因检测结果Fig.2 Detection results of 18S rRNA gene in wild rice and other materials

2.3 菰米成分实时荧光PCR特异性检测

检测收集到的4个菰米物种样品：中国菰（）、水生菰（）、沼生菰（）、德克萨斯菰（），以大米等其他谷物以及大豆、鳕鱼等异源性动植物基因组DNA作为阴性对照，进行实时荧光PCR扩增，检测引物和探针的特异性。结果显示，4个菰米物种样品均出现明显的扩增曲线，大米等其他谷物以及异源性动植物基因组DNA（图3）均无扩增检测结果，不同物种之间没有交叉反应，说明建立的实时荧光PCR检测方法具有很好的特异性。

图3 菰米的实时荧光PCR特异性检测结果Fig.3 Specific detection results of wild rice by real-time PCR

2.4 菰米成分实时荧光PCR灵敏度检测

菰米样品和鳕鱼粉样品按质量比例（100%、10%、1%、0.1%、0.01%）进行混合，提取不同浓度混合样品DNA，作为灵敏度检测模板进行实时荧光PCR检测。结果如图4所示，菰米检测方法的灵敏度可稳定达到0.01%（W/W）。

图4 模拟添加鳕鱼粉灵敏度检测结果Fig.4 Sensitivity test results of simulated added Gadus macrocephalus powder

菰米样品和易混谷物（大米、黑米和黑麦混合物）基质按质量比例（100%、10%、1%、0.1%、0.01%）进行混合，提取不同浓度混合样品DNA，作为灵敏度检测模板进行实时荧光PCR检测。结果显示如图5所示，菰米检测方法的灵敏度可稳定达到0.01%（W/W）。

图5 模拟添加易混谷物灵敏度检测结果Fig.5 Sensitivity test results of simulated mixed grains

以 1 μL浓度范围在 10～0.0001 ng/μL之间菰米基因组DNA为模板，进行灵敏度试验。结果显示，当反应体系中模板量为0.001 ng时，出现典型的扩增曲线，该方法的最低检出限为0.001 ng基因组DNA（图6）。

图6 不同DNA浓度灵敏度检测结果Fig.6 Sensitivity test results of different DNA concentrations

2.5 重复性和稳定性试验

以 1 μL 浓度分别为 10、1、0.1 ng/μL 的菰米基因组DNA为模板进行实时荧光PCR检测，以不同浓度基因组DNA获得的Ct值计算其平均数和变异系数，进行重复性和稳定性分析。结果显示，批内变异系数在0.42%～0.84%，批间变异系数在1.74%～2.91%（表3），说明建立的实时荧光PCR检测方法有较好的重复性和稳定性。

表3 菰米实时荧光PCR重复性和稳定性试验分析Table 3 Repeatability and stability of real-time PCR for wild rice detection

2.6 菰米成分实时荧光PCR法实际应用检测

对市售的进口菰米、菰米碎米以及不含菰米成分的杂粮米和混合米粉等100份样品进行检测，其中菰米样品均出现扩增曲线，均为阳性结果；
不含菰米成分的杂粮米和混合米粉样品均未出现扩增曲线，为阴性结果（表4），检测结果与商品标识一致。由大量的实际应用结果可见，本方法检测食品中菰米成分具有很好的适用性。

表4 市售菰米商品检测结果Table 4 Detection results of commercial wild rice

实时荧光PCR技术因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、速度快、全封闭反应等优点，已经成为食品安全检测的重要工具，被广泛应用于转基因成分检测、动植物源性成分检测、高经济价值农产品掺杂鉴伪、食源性致病菌检测等领域。本研究以菰米ITS基因为检测靶标，建立了菰米成分实时荧光PCR检测方法，通过分析菰米样品及其他谷物和异源性动植物样品的扩增结果、分析异源性基质（鳕鱼粉）以及易混谷物基质（大米、黑米和黑麦混合物）与菰米梯度混合后实时荧光PCR检测的灵敏度、分析菰米基因组DNA浓度梯度实时荧光PCR检测的灵敏度、测试菰米实时荧光PCR检测方法的重复性和稳定性，验证了本研究所建立的实时荧光PCR检测方法特异性强，与对照组无交叉反应，检测灵敏度为0.001 ng/μL菰米基因组DNA或0.01%（W/W）的菰米粉，可快速高效地进行菰米成分的定性检测，为出入境商品中菰米的真实性甄别以及菰米成分检测的标准化提供技术支撑。本方法的建立将填补我国菰米检测的空白，对促进我国菰米产业及进出口贸易的稳定发展具有重要意义。