[管花肉苁蓉对试验大鼠抗疲劳功效的研究]疲劳试验怎么做

　  

　**农业大学大学生创新项目

　申 请 表

　项目名称：管花肉苁蓉对试验大鼠抗疲劳功效的研究

　 项目负责人：***  联系电话：132****2248 

　 所在学院：动物医学学院                   

　 项目参加人：_______________________________

　指导教师：****  联系电话：13999898721 

　 导师职称：助教      所在单位：动物医学学院

　 填表日期：2017年11月19日               

　**农业大学教务处制

　项目

　名称

　管花肉苁蓉对试验大鼠抗疲劳功效的研究

　项目

　负责人

　姓   名

　学号

　班级

　***

　220151264

　M动医153班

　项

　目

　组

　成

　员

　姓    名

　学号

　班级

　在项目组的分工

　查阅、收集文献

　实验操作

　数据统计

　实验操作

　1、项目的立项依据（2000字，研究意义、国内外研究现状简析；或者结合专业学习与实践发现的问题，或者结合科技工作及社会生产需要解决的关键科技问题论述该创新项目的应用价值与前景。附主要参考文献。）

　肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma ），为列当科（Orobanchaceae）肉苁蓉属（Cistanche）的寄生植物。肉苁蓉性温、味甘，是一种名贵的中、维医药材，《本草纲目》载：“此物补而不峻，故有从容之号”。民间常在每年3～5月采集半埋于沙土中，晒干后用于治疗男性阳痿、遗精早泄、宫寒不孕、腰膝酸软、肾脏寒虚，老年便秘等疾病。

　因生长在我国西北地区的荒漠中，素有“沙漠人参”之美誉[1-2]。我国的肉苁蓉中荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉的药用价值最高，已证实主要作用和药理活性相似。与此同时，肉苁蓉作为著名的补益药材，引起国际医药界的普遍重视，对肉苁蓉的有效成分分析、生物活性、药理作用等机理的研究日益增多。现代医学研究证实肉苁蓉含有列当素、生物碱、酵素、糖类及脂类等，药理学研究表明有提高机体免疫、调节中枢神经系统和内分泌功能，改善性功能、提高记忆能力、抗动脉粥样硬化、抗衰老及预防老年痴呆等作用[3-4]，此外另有文献报道，肉苁蓉具有护肝、降压作用、呼吸麻醉作用等[5]。

　    随着现代药物活性成分提取、分离和检测技术的发展，表明管花肉苁蓉主要化学成分为苯乙醇苷类化合物、苁蓉多糖、环烯醚萜类化合物等活性成分。目前从肉苁蓉中提取到30余种苯乙醇苷类物质[6]。

　    管花肉苁蓉作为著名的补益中药，引起国际医药界的普遍重视，对管花肉苁蓉药理作用的研究向各方向开展，主要包括对免疫、抗应激、内分泌、中枢神经、消化、抗衰老作用等[7]。已证实管花肉苁蓉在抗氧化、抗病毒（菌）、抗肿瘤、增强记忆、免疫调节和强心等方面都显示了一定的活性，而且其新的用途仍在不断发现之中。在**地区，代表方药制剂买提布合头西干扎地克汤，人们常将肉苁蓉作为食材与羊肉、刺糖、枸杞子、小豆蔻、欧缬草、欧白一起慢炖后用于补肾壮阳。目前市面可见各种颗粒状、口服液和丸剂等肉苁蓉药物。

　    研究表明很多抗衰老中药中均含有松果菊苷、苯乙醇苷类化合物，如管花肉苁蓉、列当、地黄、玄参、马先蒿等，特别是管花肉苁蓉中含量最高可达30%，能提高机体自由基清除酶超氧化歧化酶的活性，降低脂质过氧化物含量，减少自由基对机体的损伤而达到延缓衰老、消除疲劳的作用，也逐步被现代药理实验所证[8]。肉苁蓉多糖和D-甘露醇能显著引起小鼠延长皮肤衰老，提高免疫，激活超氧化歧化酶酶及降低体内醋褐质堆积作用[9]。同时能提高肝脏抗氧化能力，减少肝脏线粒体氧化损伤，而达到延缓衰老的作用[10]。肉苁蓉多糖类物质能使衰老的小鼠肺组织、红细胞中超氧化歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力显著提高，肺及血浆中丙二醛含量降低，降低肺胶原蛋白含量，增加弹性蛋白含量，能预防亚急性衰老小鼠的组织脂质氧化损伤，提示肉苁蓉多糖类物质具有抗氧化性损伤和抗肺衰老的作用[11-12]。另有研究表明肉苁蓉总苷对小鼠组织的抗氧化作用很强，能显著提高脑、肾组织中超氧化歧化酶活性，并显著降低各组织丙二醛及脂褐质含量。提出肉苁蓉总苷能有效地提高机体组织抗氧化能力，防止组织脂质过氧化损伤[13]。此外肉苁蓉水煎液能提高运动耐力和加速消除疲劳，降低老龄小鼠脑、肝组织中过氧化脂质含量，增强机体对自由基的清除活动而起到抗衰老作[14-15]。通过建立模型组表明肉苁蓉能显著改善不同天小鼠的学习、记忆功能，升高脑组织的超氧化歧化酶活性，对海马CA1区组织结构形态学改变有保护作用，提示肉苁蓉可能是通过抗氧化的机制达到改善脑老化的作用[16]。

　    管花肉苁蓉提取物能对心脏有明显的保护作用，研究表明肉苁蓉总苷对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤，心脏缺血，阿霉素所致小鼠心肌毒性等都证明具有一定的保护心肌作用[17-20]。采用结扎冠状动脉造成大鼠心肌缺血模型，结果表明肉苁蓉总苷能明显改善缺血心电图，减小心肌梗死面积，提高心肌组织磷酸肌酸激酶活性，具有缺血心肌保护作用[21]。另有报道异丙肾上腺素所致小鼠心肌损伤具有保护心肌损伤和抗脂质过氧化作用[22]。肉苁蓉具有提高大鼠运动能力和心肌线粒体抗氧化酶活性的作用，从而减轻自由基对心肌线粒体膜和浆网膜造成损伤，抑制大强度力竭运动造成的心肌线粒体氧化损伤，延缓疲劳[23]。

　运动性疲劳及其恢复过程的研究已有近百年历史，中医药对运动性疲劳的作用引起国内外学者广泛注意，国内研究者证实了部分中药具有抗疲劳作用[24]，如冬虫夏草﹑蛹虫草[25]﹑佛甲草[26]﹑复方泥鳅超微粉胶囊[27]﹑黑加仑提取物[28]﹑糖槭[29] ﹑菊花[30]﹑杞蜜**参、石**、哈士蟆油酶解物、益脂灵颗粒剂、营养补充剂等均增强机体活力和适应能力及对抗机体疲劳的作用[31-35]。

　目前，对管花肉苁蓉的相关基础研究已较为深入，涉及化学成分等方面，其药理作用也为现代药理学所证明。管花肉苁蓉因其显著的药理活性在**民间有着悠久的应用历史，本研究采用**特有的管花肉苁蓉对试验大鼠进行游泳疲劳模型，筛选管花肉苁蓉有效成分（单体），对试验大鼠进行给药，重点研究管花肉苁蓉对抗疲劳，抑制产生自由基、抗氧化物等影响，最终为**天然植物药降低动物在运动过程中产生的疲劳程度最初步研究，为提高**特有的动植物性中药药效成分和预防与恢复运动性疲劳奠定科学基础。

　参考文献：

　[1]宋志宏,雷丽,屠鹏飞.肉苁蓉属植物的药理活性研究进展[J].中草药,2003,09:113-115.

　[2]Fu G, Pang H, Wong Y H. 2008. Naturally occurring phenylethanoid glycosides: potential leads for new therapeutics[J]. Curr Med Chem, 15: 2592-2613.

　[3]徐朝晖,杨峻山,吕瑞绵,杨松松.肉苁蓉化学成分的研究[J].中草药,1999,04:244-246.

　[4]成喜雨,郭斌,倪文,刘春朝.肉苁蓉研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,02:235-241+222.

　[5]Jiang Y, Tu P F. 2009.Analysis of chemical constituents in Cistanche species[J]. Chromatogr A, 1216:1970-1979.

　[6]Wang T, Zhang X Y, Xie W Y. 2012. Cistanche Deserticola Y. C. Ma, “Desert Ginseng”：Review. Am J Chin Med, 40, 1123-1141.

　 [7]朱咏华,罗泽民.肉苁蓉的研究进展及前景分析[J].湖南林业科技,2000,(4): 19-22.

　[8]蔡鸿,鲍忠,姜勇,王新意,樊兴土,艾尔肯?买提肉孜,屠鹏飞.鲜管花肉苁蓉加工工艺[J].中国中药杂志,2007,13:1289-1291.

　[9]景富春,陈虹.肉苁蓉的神经保护作用研究进展[J].时珍国医国药,2006,10:1878-1879.

　[10]徐辉,魏晓东,欧芹,李莹,徐晓霞,王景涛,田国忠.肉苁蓉不同成分抗衰老作用的研究[J].黑龙江医药科学,2011,01:1-2.

　[11]孙云,王德俊,祝瑾,张洪泉.肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺蛋白含量与抗氧化功能关系的影响[J].中国药理学通报,2001,01:101-103.

　[12]吴波,付玉梅.肉苁蓉多糖对衰老小鼠脂质过氧化的影响[J].**医学院学n报,2004,04:27-28.

　[13]王晓雯,李琳琳,木胡牙提,王雪飞,堵年生.肉苁蓉总甙对小鼠组织的抗氧化作用[J].中国中药杂志,1998,09:43-44+66.

　 [14]朱秋霜,姜富,任春清,王军,何丽华,粟波.肉苁蓉对老龄小鼠脑、肝脏过氧化脂质含量的影响[J].**医学院学报,1998,01:3-4.

　[15]孙建,罗慧英.肉苁蓉水煎剂对运动小鼠抗疲劳能力的影响[J].**中医学院学报,2009,04:10-12.

　[16]王**,王晓雯,王雪飞,蒋晓燕,帕尔哈提.肉苁蓉总苷对D-半乳糖脑老化模型小鼠的保护作用[J].中国行为医学科学,2004,06:17-19.

　[17]木胡牙提?吾拉斯汉,王晓雯,王雪飞,李琳琳,堵年生.肉苁蓉总苷对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].**医科大学学报,2001,03:195-197.

　[18]邬利娅?伊明,王晓雯,王雪飞,海力曼?依拉洪,谢瑶芸,堵年生.肉苁蓉总苷对阿霉素所致小鼠心肌毒性的保护作用[J].**医科大学学报,2003,01:28-30.

　[19]李宇晶,杨**,康金国.**玫瑰花、肉苁蓉对大鼠缺血心肌的保护作用[J]. **中医药,1998,01:49-51.

　[20]海力曼?依拉洪,邬利娅?伊明,王晓雯.肉苁蓉总苷对阿霉素所致小鼠心肌线粒体损害的保护作用[J].**医科大学学报,2004,02:128-130.

　[21]毛新民,王晓雯,李琳琳,王雪飞.肉苁蓉总苷对大鼠心肌缺血的保护作用[J].中草药,1999,02:118-120.

　[22]王晓雯,周康,王雪飞,玛依努尔,依巴代提,堵年生.肉苁蓉总苷对异丙肾上腺素所致小鼠心肌损伤的保护作用[J].**医科大学学报,2000,03:202-204.

　[23]周海涛,曹建民,林强. 肉苁蓉对大鼠力竭游泳能力和心肌线粒体抗氧化能力的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,06:229-233.

　[24]王长虹,张冰,张宇,等.复方枳实合剂对实验动物的抗疲劳作用研究[J]．**医学院学报，2001，(01):14-17．

　[25]韩彦彬,赵鹏,李彬,等.虫草片抗疲劳功能的动物实验研究[J].中国卫生检验杂志,2009,(11):2498-2499+2521．

　[26]周青,刘建新,周俐.佛甲草抗疲劳作用的动物实验[J].中国临床康复,2005,(47):93-95．

　[27]张家国,孙静,潘洪民.复方泥鳅超微粉胶囊抗疲劳的动物性实验研究[J].食品研究与开发,2012,(09):174-177．

　[28]赵君操,刘瑞雪,罗彬.黑加仑提取物抗疲劳作用的动物实验研究[J].河南医学研究,2011，(02):131-133．

　[29]张桂英,赵海军,信振江,等.枫糖对小鼠抗运动疲劳能力的影响[J].西安交通大学学报(医学版)，2008,(06):644-646.

　[30]胡春,丁霄霖,唐莉莉,等.菊花提取物对实验动物抗疲劳和降血脂作用的研究[J].食品科学,1996,(10):58-62．

　[31]高峰,仲路华,于淑莲,等.杞蜜**参抗疲劳、抗缺氧动物实验研究[J].人参研究,2001,(01):23-24．

　[32]刘建新,周俐,周青,等.石**抗疲劳和耐缺氧作用的动物实验(英文)[J].中国临床康复,2006,(07):157-159．

　[33]邢之华,李家邦,赵劲风,等.益脂灵颗粒剂对实验性动物抗疲劳作用的影响[J].湖南中医学院学报,1999,(01):19．

　[34]暴国,王宁,张树成,等.孕期营养补充剂抗疲劳、耐寒、耐热动物实验观察[J].中国计划生育学杂志,2014,(04):235-238．

　[35]动物性生药及食品的抗疲劳作用[J].国外医学(中医中药分册),2000,(01):35．

　2、项目的研究内容，及拟解决的关键科学问题

　目前，对管花肉苁蓉的相关基础研究已较为深入，涉及化学成分等方面，其药理作用也为现代药理学所证明。管花肉苁蓉因其显著的药理活性在**民间有着悠久的应用历史，本研究采用**特有的管花肉苁蓉对试验大鼠进行游泳疲劳模型，筛选管花肉苁蓉有效成分（单体），对试验大鼠进行给药，重点研究管花肉苁蓉对抗疲劳，抑制产生自由基、抗氧化物等影响，最终为**天然植物药降低动物在运动过程中产生的疲劳程度最初步研究，为提高**特有的动植物性中药药效成分和预防与恢复运动性疲劳奠定科学基础。

　3、项目的研究方案（主要研究方法、实验手段与技术、技术路线）

　3.1 主要研究方法

　（1） 通过醇提法对管花肉苁蓉有效成分进行高效提制；

　（2） 建立泳池疲劳动物模型，检测血液指标、肝组织样指标、肌组织样指标；并筛选管花肉苁蓉抗大鼠疲劳主要活性成分（单体）。

　3.2 实验手段与技术

　（1）管花肉苁蓉活性成分分离鉴定：用回流提取法对管花肉苁蓉进行粗提取，减压蒸馏法对提取物进行浓缩，大孔树脂及葡聚糖凝胶色谱柱的提取物进行分离纯化，液液萃取法或高效液相色谱法（HPLC）对各部位的混合物进行进一步分离纯化制备，联合质谱法、红外光谱法或核磁共振波普法对各物质进行化学鉴定，确定分子量及结构式。

　（2） 动物处理：SD大鼠，雄性，200±4.5g。大鼠适应性饲养3 d 后经预游泳实验选取游泳姿势正确的小鼠按体重随机分实验组和对照组。对照组灌胃生理盐水，实验组灌胃中药按照中药的剂量分低剂量、中剂量、高剂量测定各项指标；大鼠随机分安静组：灌胃 0.9％生理盐水，不运动；运动不给药组：灌胃 0.9％生理盐水后进行运动训练；运动给药组：灌胃中药后进行运动训练。

　SD大鼠先适应性喂养3 d，同时每天进行15 min适应性游泳训练1次，将游泳时间少于15min 的大鼠筛除，训练时间为期30d。大鼠于游泳箱中进行中等强度游泳训练，水深 60cm，水温 34～36℃。大鼠每周训练5 d，每天游泳训练1次，第1次下水游5min，此后逐日累加，第1周末时每天游20-30min，第2周末时每天游40-50min，第 3，4 周每天游50-60min，30d后测定各项指标。

　    饲养条件：小鼠的生活环境要求安静、清洁、自然光照；垫料保持干燥卫生，定期更换饲料；饮水充足；小鼠的饲料应特别注意，要求必须保持营养物质的平衡稳定，并富有蛋白质，否则会影响其生长发育和抵抗疾病的能力。

　每早10:00～11:00灌胃，13:00添加饲料，饮水照常，每晚7:00 添加饲料，灌胃给药阶段每日晚9:30停食。每周一、四更换饮水瓶，饮水瓶和吸水管预先清洗并消毒。每周二、五更换垫料，隔天称量体重、记录。

　（3）采样：每采样时间点随机选取每组8只**大鼠灌胃30d后进行称重，游泳，眼球采血测定生理生化指标。SD大鼠灌胃30d后进行称重，游泳，眼球采血测定生理生化指标，断头处死，取大鼠双侧股四头肌，于液氮中保存，后放于低温冰箱（-80℃）中保存。

　（4）试验方法与测定内容

　1） 记录大鼠游泳时间；

　2）检测生理生化指标血糖、乳酸、甘油三酯、游离脂肪酸（游脂酸）、白蛋白、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）；

　3）病理组织切片的制作；

　4）利用紫外分光光度计测定肝肌糖原、血清尿素、血乳酸度；

　3.3技术路线

　4、本项目的创新之处

　本研究采用**特有的管花肉苁蓉对试验大鼠进行游泳疲劳模型，筛选管花肉苁蓉有效成分（单体），研究管花肉苁蓉对抗疲劳，抑制产生自由基、抗氧化物等影响。

　5、研究计划

　（注意：本批校级项目起始时间统一为2017年11月30日，完成时间要求在2018年11月1日以前）

　1）2017 年 11 月 30 日-2017 年 12 月 31 日，查阅文献、拟定详细试验方案

　2）2018 年 1 月 1 日-2018 年 6 月 30 日，进行实验，分析数据

　3）2018 年 7 月 1 日-2018 年 10 月 31 日，撰写论文，发表论文，申请项目验收

　6、预期的研究结果

　发表学术论文 1 篇。

　7、指导教师近五年主持或参与的科研项目（限填五项）

　起止年月

　项目名称

　项目的来源

　排名

　2013年5月2015 年6月

　管花肉苁蓉对小鼠心血管功能的影响

　教育厅研究生创新项目（结题）

　主持

　2015年11月

　2016年11月

　黑果小檗对 CCl4 引起肝损伤的保护试验

　**农业大学大学生创新项目（结题）

　指导教师

　2015年11月

　2016年11月

　生物药剂学课程建设

　**农业大学 2016 年校级教研教改项目（结题）

　主持

　2016年5月

　2017年12月

　犊牛致腹泻性大肠杆菌的基因型和耐药性检测分析

　**农业大学校前期项目（在研）

　主持

　2016年11月

　2017年11月

　菊苣醇提物对小鼠 CYP 2E1 的影响

　**农业大学大学生创新项目（在研）

　指导教师

　8、申请经费概算及简要说明

　1．科研业务费

　预算经费

　备注（计算依据与说明）

　(1)测试

　0

　(2)计算

　0

　(3)分析费

　0

　(4)动力、能源费

　500元

　交通运输

　(5) 资料、论文版面费、印刷费、文献检索费

　1000元

　打印材料，购买书籍，版面费

　(6) 其他

　0

　2．实验材料费

　(1)原材料

　1000元

　购买实验动物，耗材

　(2)试剂、药品费

　2000元

　购买抗体

　(3)其他

　0

　合计

　5000元

　与本项目相关的

　其他经费来源

　学院

　导师

　其他经费来源合计

　表格内容添写空间不足时可加页。

　注：  校级大学生创新项目经费只能支付 “科研业务费”和“实验材料费”，不得支付劳务费、仪器设备的购置费、通讯费、机票费、餐费和接待费。

　9、诚信承诺

　本项目全体成员郑重承诺，该项目研究将遵守学校有关规定，恪守学术规范，不抄袭他人成果，不弄虚作假，先诚实做人，再诚信做学问和研究，按项目研究进度和合同约定的内容保质保量完成各项研究任务。如有违规行为，愿承担一切责任，接受学校的处理。

　项目负责人签字：

　指导教师签字：

　                                             年   月   日

　 10、学院审核意见：

　学院领导签字：

　 单位盖章

　  年   月   日

　表格内容添写空间不足时可加页。

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