ALA-PDT对兔耳增生性瘢痕抑制效应及作用机制的初步研究|抑制瘢痕增生的外用药

　　[摘要]目的：观察ALA-PDT (5-氨基酮戊酸光动力疗法)对兔耳增生性瘢痕形成的抑制作用及对转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。方法：在兔耳腹侧面做直径1cm大小全层皮肤缺损创面3个/侧，共60个。随机分为以下三组：高浓度ALA-PDT组(n=20)：20%ALA介导PDT治疗；低浓度ALA-PDT组(n=20):10%ALA介导PDT治疗;对照组（n=20）：不做治疗，待创面自然愈合。在创面形成术后的第6天、第13天分别进行ALA-PDT治疗，观察治疗组与对照组之间的瘢痕形成率、瘢痕增生指数、胶原纤维含量及TGF-β1表达情况的差异。结果：ALA-PDT治疗降低了瘢痕形成率，其中药物高浓度ALA-PDT组与对照组的差异有统计学意义（P＜0.01）；药物高浓度ALA-PDT组和药物低浓度ALA-PDT组的瘢痕增生指数、胶原纤维含量与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）；药物高浓度ALA-PDT组与对照组之间的TGF-β1的表达差异具有统计学显著性（P＜0.05）。结论：ALA-PDT对兔耳增生性瘢痕的形成有抑制作用，从而预防创伤后增生性瘢痕形成，该作用可能通过减少TGF-β1的产生而实现。
　　[关键词]光动力疗法；增生性瘢痕；胶原纤维；转化生长因子β1
　　[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）01-0083-04
　　
　　Preliminary study in the inhibitory effect and mechanism of ALA-PDT on the hypertrophic scar model in rabbit ears
　　ZENG Wei-hui,WANG Qian-qian,QIN Jing-jing,GENG Song-mei,XU Lei,NIE Jian-jun
　　(Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital,Xi"an Jiaotong University,Xi"an 710004,Shaanxi,China
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the ability of ALA-PDT (5-Aminolaevulinic Acid-based Photodynamic Therapy)in reducing hypertrophic scar formation in a rabbit ear model and further to observe the expression of TGF-β1 (transforming growth factor-β1).MethodsThe acute dermal wound models on white rabbits" ears were established. 60 scars were randomly divided into 3 groups: the high concentration ALA experimental group (n=20) received 20%ALA PDT treatment while the low one (n=20) received 10%ALA PDT treatment, and the controlled group (n=20) received no special treatment. The experimental groups received ALA-PDT treatment at two time points postwounding:days 6,13. Specimens were harvested from scars on postoperative 28 days and scar elevation index, fiber collagen contents were measured,TGF -β1 expression was tested by immunochemical staining.ResultsCompared with the controlled group, scar formation rate in high concentration ALA-PDT treatment group was reduced significantly (P 　　1.2.2 处理过程：剪大小约1.2cm的圆形医用棉，覆盖于创面，将配好的5-氨基酮戊酸药液浸湿医用棉，再用保鲜膜贴在医用棉上，垫上纱布，覆盖上黑色塑料纸，最后医用胶布粘贴封包，3h后进行激光照射。
　　1.2.3 光照条件：采用XD-635AB型光动力激光治疗仪，为半导体激光，波长635nm，总输出能量180.30J，输出能量密度 229.60 J/cm2，输出功率 300mW，监测功率300mW，光斑大小 1cm，光照时间10min/创面。
　　1.3标本取材及处理：兔耳腹侧创面形成术后28天，麻醉方法同前，用手术刀切取兔耳全层，周边带有少许正常组织，4%甲醛溶液固定24h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片，5μm 厚度，进行HE、masson胶原染色及TGF-β1免疫组化。
　　1.4观察指标
　　1.4.1瘢痕形成率：瘢痕组织高出皮面〉2mm，硬度与兔耳软骨相似时即为增生性瘢痕。
　　1.4.2瘢痕增生指数（Hypertrophic Index,HI）：HE染色组织切片于低倍镜下用测微尺测量 ,按公式HI=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度；B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度。
　　1.4.3 Masson胶原染色：每张切片中随机选5个视野，以蓝色为阳性，利用图像分析系统，分析胶原纤维的含量。
　　1.4.4免疫组化TGF-β1结果判断标准：TGF-β1着色强度分级：其阳性表达为棕黄色颗粒状，定位于细胞浆。每例标本选取5个高倍镜视野计数，采用盲法进行图像分析，将观察材料分成4 组：染色细胞数少于细胞总数的10%为(-)；细胞胞浆着色为浅黄色，染色细胞数占细胞总数的10%～30% 为(+)；细胞胞浆着色为棕黄色，染色细胞数占细胞总数的30%～60%为(++)；细胞胞浆着色为深棕色，染色细胞数占细胞总数的60% 以上为(+++)。
　　1.4统计分析：本研究的结果数据应用SPSS 13.0统计软件进行分析，显著性水准取双侧，α=0.05。瘢痕形成率的差异使用卡方检验，瘢痕增生指数及胶原纤维含量数据使用方差分析，免疫组化TGF-β1数据使用秩和检验分析。
　　
　　2结果
　　2.1大体观察结果：对照组创面愈合区组织明显高于周围正常皮肤，表现为瘢痕中央呈乳头状突起，呈淡红色，质韧，增生块高出皮面，其增生范围不超过原有创缘。ALA-PDT组愈合区略高于正常皮肤，色泽较淡。
　　2.2 HE染色结果：对照组皮肤组织镜下显示：真皮层明显变厚 ,为周边正常真皮层厚度的 3～4倍,其间有炎性细胞浸润及毛细血管扩张。治疗组真皮层厚度约为正常真皮层厚度的1.5～2倍（见图1）。
　　2.3 Masson胶原纤维染色结果：胶原纤维呈蓝色。对照组真皮层可见大量排列紧密，紊乱粗大的深蓝色胶原纤维，可见大量梭形成纤维细胞。治疗组真皮层蓝色胶原纤维染色相对淡浅，排列稀疏整齐，成纤维细胞数量减少（见图2）。经图像分析对胶原纤维进行半定量分析，结果见表1。
　　2.4结果分析：(瘢痕形成率、瘢痕增生指数、胶原纤维含量、免疫组化TGF-β1表达情况详见表1，表2、图3。)
　　ALA-PDT治疗降低了瘢痕形成率，瘢痕形成率经卡方检验，三组之间不完全相等（χ2=11.400，P=0.003，P0.05）。药物高浓度ALA-PDT组与低浓度ALA-PDT组之间无显著性差异（χ2=3.636，P=0.057，P>0.05）。
　　三组瘢痕增生指数经方差分析（F=17.266，P=0.000，P0.05）。
　　三组胶原纤维含量经方差分析（F=35.561，P=0.000，P0.05）。
　　三组TGF-β1的表达数据经秩和检验（Hc=8.562，P=0.014，P0.05）。药物低浓度治疗组与对照组之间无显著差异（Hc=1.446，P=0.148，P>0.05）。药物高浓度治疗组与对照组之间有显著性差异（Hc=2.932，P=0.003，P 　　TGF-β是与病理性瘢痕形成关系最为密切的细胞因子，参与瘢痕形成，是导致ECM（细胞外基质）过度密集的最密切的正性调控因子之一。其中TGF-β1通过促进ECM 的合成和抑制其降解来达到促纤维化发展的目的。在瘢痕愈合早期（术后一周左右）,TGF-β1对创面肉芽组织生长修复具有促进作用，局部TGF-β1在上皮愈合后的持续高表达则被认为是继发瘢痕形成的关键因素。Santiago B等[6]和Spyrou GE等[7]最近研究发现，TGF-β1在皮肤纤维化中起着至关重要的作用。本实验通过对实验组和对照组TGF-β1表达差异的研究，探索ALA-PDT对增生性瘢痕的抑制作用是否与降低TGF-β1有关。结果发现，药物高浓度ALA-PDT组与对照组相比，TGF-β1的表达下降，具有统计学差异(P0.05)，而药物高、低浓度ALA-PDT组之间比较，TGF-β1的表达虽有数据上的差别，但无统计学差异(P>0.05)。
　　本研究提示ALA-PDT对增生性瘢痕形成过程具有明显抑制作用，因此可以预防创伤后增生性瘢痕形成，而药物高浓度ALA-PDT组在抑制瘢痕形成上具有更好的效果。因此，高浓度5-氨基酮戊酸（ALA）光动力治疗明显影响增生性瘢痕的转归，更具有临床推广应用的动物实验基础。该过程可能通过抑制TGF-β1的表达起作用，但其具体作用机制还有待进一步研究。
　　
　　[参考文献]
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　　[2]蔡宏，顾瑛,曾晶,等.HMME-PDT对兔耳增生性瘢痕块成纤维细胞增殖能力及其超微结构的影响[J].中国激光医学杂志,2008,17(3):158-161.
　　[3]孙晓燕,王星武,郭党学,等.ALA光动力治疗兔耳增生性瘢痕模型的实验研究[J].中国美容医学,2009,18(7):973-976.
　　[4]Blaha J．Physiology and pathology of skin after burns and derangement of gene expression[J]．Acta Chir Plast,2006,48:127-132．
　　[5]Morris DE,Wu L,Zhao LL,et al. Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring: quantitative studies[J]. Plast Reconstr Surg,1997,100(3): 674-681.
　　[6]Santiago B,Gutierrez CI,Dotor J,et al. Topical application of a peptide inhibitor of transforming growth actor-beta1 ameliorates bleomycin - induced skin fibrosis[J]. J Invest Dermatol,2005,125(3):450-455.
　　[7]Spyrou GE, Naylor IL. The effect of basic fibroblast rowth factor on scarring[J]. Br J Plast Surg,2002,55(4):275-282.
　　
　　[收稿日期]2010-10-19 [修回日期]2010-12-23
　　编辑/张惠娟