Ad-EGFP修饰的MSCs在糖尿病足溃疡大鼠体内的示踪及疗效观察:糖尿病足溃疡

　　[摘要]目的：观察自尾静脉移植Ad-EGPF修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在糖尿病足溃疡模型大鼠胰腺、肾脏及溃疡局部的示踪情况，并观察移植后大鼠血糖、体重及溃疡面积的改变情况。方法：贴壁法体外分离培养Wistar大鼠BMSCs，传代培养后用携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-EGFP)以感染复数(MOI=150)体外转染。60 只Wistar大鼠，雌雄各半，随机分为3 组；糖尿病治疗组(糖尿病足溃疡大鼠细胞移植治疗组)、糖尿病对照组(糖尿病足溃疡大鼠PBS对照组)使用链脲菌素(STZ)诱导糖尿病模型后，连同正常对照组(正常足溃疡大鼠PBS对照组)制作足部溃疡模型。造模成功后，糖尿病治疗组经尾静脉注射转染Ad-EGFP 72h后的BMSCs悬液0.5 ml(细胞数5×106个)，糖尿病对照组及正常对照组注射等量PBS溶液。分别于细胞移植后7 天、14 天、21 天测量体重、空腹血糖水平、足部溃疡面积；并于细胞移植后14 天，观察BMSCs在胰腺、肾脏及足溃疡局部的分布情况。结果：移植后14天可在糖尿病大鼠胰腺、肾脏及皮肤溃疡面观察到Ad-EGFP标记的BMSCs. 糖尿病治疗组大鼠体重明显恢复、血糖显著降低、足溃疡愈合加速，与糖尿病对照组相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论：BMSCs具有归巢特性，并可能对糖尿病及足溃疡有一定的治疗效果。
　　[关键词]骨髓间充质干细胞；糖尿病；溃疡；移植；归巢
　　[中图分类号]R332[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）10-1571-04
　　
　　Study of diabetic foot ulcer transplanted with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with Ad-EGFP in rats
　　LIANG Wen-Jia1, CAI Qian2, LIU Yi2
　　(1.Second Clinical Medical College, Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China; 2.Department of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Area Command of Chinese PLA,Lanzhou 730050,Gansu,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the distribution of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transfected with Ad-EGFP in kidney and pancreatic tissues, and the variation of blood glucose, weight and ulcer area after cell transplantation, in model rats of diabetic foot ulcer.MethodsMSCs isolated from Wistar rats were cultured in vitro and were then transfected with green fluorescent protein (Ad-EGFP) at the multiplicities of infection (MOI) of being 150. The BMSCs were obtained for transplantation. Sixty Wistar rats were randomly assigned to 3 groups: diabetic treatment group (diabetic foot ulcer rat treated with the transfected BMSCs), diabetic control group (diabetic foot ulcer rat treated with PBS) and normal control group (normal ulcer rat treated with PBS). The two groups of diabetic rat model were achieved by intraperitoneally injection of streptozotocin. Foot ulcer for the three groups was manually scratched. For rats in diabetic treatment group, 0.5 ml BMSCs (cell count 5×106) obtained 72 hours after transfected with Ad-EGFP were injected via tail vein, while these in two control groups were injected with PBS of same volume. The variation of blood glucose, weight and ulcer area were observed on the 7th, 14th and 21th after cell transplantation, and the distribution of BMSCs in kidney and pancreatic tissues in rats on diabetic treatment group were examined.ResultsIn diabetic treatment group, the BMSCs were detected at pancreas, kidney and foot ulcer after 14th day of transplantation. As compared to control group, therapy using the BMSCs decreased blood glucose level, improved symptom of magersucht and accelerated the healing of ulcer.ConclusionThe results indicated BMSCs had the capability of nesting and may have beneficial effects in the management of diabetics and associated foot ulcer.
　　Key words: bone marrow mesenchymal stem cells; diabetics; ulcer; transplantation; nesting
　　
　　胰岛β细胞功能障碍导致胰岛素分泌不足以维持机体血糖的稳定是糖尿病的主要发病机理[1]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类来源于中胚层的干细胞，可跨胚层分化为各类细胞，其容易分离和培养扩增，自我更新能力强，可塑性高，对受损的组织和器官具有较强的修复能力，在糖尿病及其并发症的治疗中具有一定优势。因此，本实验经大鼠尾静脉异体移植BMSCs，初步观察其在胰腺、肾脏及溃疡组织中的存活及转归，期望从体内角度分析BMSCs在糖尿病及其并发症的治疗中的可行性及应用前景。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物：SPF级Wistar大鼠5只，体质量(100 ±20)g，用于BMSCs的分离、培养；SPF级Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，均由甘肃省中医学院提供。
　　1.1.2 试剂及仪器：Ad-EGFP (本实验室构建)；DMEM-F12培养基和胰酶(GIBCO公司)；胎牛血清(兰州民海公司)；链脲菌素(STZ) ( Sigma公司)；血糖试剂盒(四川迈克科技公司)；CO2细胞培养箱(Heracell公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；荧光倒置显微镜(Olympus公司)。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 大鼠MSCs的分离、培养及纯化：SPF级Wistar大鼠，（100 ±20）g，脱颈处死后，于超净工作台内无菌取出双侧股骨、胫骨，用DMEM-F12培养液冲出骨髓，采用全骨髓贴壁法培养，37℃、5% CO2孵箱内培养72 h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每3 天换液1次。待细胞长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，l:3比例传代。
　　1.2.2 重组腺病毒载体Ad-EGFP转染大鼠BMSCs：3代BMSCs接种于10mm培养皿，待生长至80%融合后，弃去上清，加入含Ad-EGFP腺病毒的DMEM-F12培养液(MOI=150)孵育2h后，将培养液更换为含5%FBS的DMEM-F12培养液，37℃、5%CO2孵箱培养，48h后荧光显微镜观察绿色荧光强度。
　　1.2.3 动物模型制备及细胞移植：60只SPF级Wistar大鼠，体重(200±20)g，雌雄各半，随机分为：糖尿病治疗组(糖尿病足溃疡大鼠细胞治疗组)、糖尿病对照组(糖尿病足溃疡大鼠PBS对照组)及正常对照组(正常足溃疡大鼠PBS对照组)。前两组高脂饲料(向标准混合饲料中添加含10%猪油、2.5%蛋黄及20%蔗糖高脂高糖成分)喂养2个月后，腹腔内注射链脲菌素1次(30mg/kg)，正常对照组采用标准混合饲料喂养2个月后，腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液。一周后眼球后静脉丛采血测量血糖，空腹血糖 ≥16.7mmol/L视为大鼠糖尿病造模成功。3组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，足背部作一3mm×7mm的矩形切口并移除全层皮肤，视为足部溃疡造模成功(记为第0天)。于第1天，细胞移植组经尾静脉注射转染Ad-EGFP 72 h后的BMSCs悬液0.5ml(细胞数5×106个)，其余两组注射等量PBS溶液。
　　1.2.4 观察指标：①分别于细胞移植后7 天、14 天、21 天测量体重、空腹血糖水平及足部溃疡面积；②细胞移植后14 天，断颈处死，取胰腺、肾脏及溃疡创面新鲜组织，立即冰冻切片，片厚7μm，荧光显微镜下观察EGFP-BMSCs在胰腺、肾脏及溃疡局部的分布情况。
　　1.2.5 统计学方法：采用SPSS11.0统计软件对所测数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示，两个均数比较用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1 Ad-EGFP转染大鼠BMSCs：应用Ad-EGFP转染大鼠BMSCs(MOI=150)，转染效率可达88%以上，转染48 h后，细胞荧光明显增强(图1)，荧光倒置显微镜下可见发绿色荧光的BMSCs呈宽大扁平形及梭形分布。荧光强度3～5 天达到顶峰，40 天后仍能观察到荧光。
　　2.2 移植后体重变化：正常对照组体重基本稳定，糖尿病对照组体重呈持续下降趋势。糖尿病治疗组在移植后7 天内体重呈下降趋势，14天已开始上升，至21天接近正常对照组水平，差异无统计学意义(P=0.098)；与糖尿病对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05) ；与细胞移植后7天相比，体重增加约18%，差异有统计学意义(P＜0.05)（图2）。
　　2.3 移植后血糖变化：糖尿病治疗组血糖在移植后7 天内与糖尿病对照组相比尚无差异，14 天逐渐降至(19.68± 0.73)mmol/L，21 天降至(17.35±0.89) mmol/L，与0 天相比差异有统计学意义(P＜0.05)；糖尿病对照组血糖稳定在较高水平，21 天达(25.32±1.67)mmol/L，与糖尿病治疗组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。糖尿病对照组及正常对照组血糖移植前后差异均无统计学意义（图3）。
　　2.4 移植后溃疡面积比较：见图4。由图可见，足溃疡造模当天(0 天)三组溃疡面积比较后无统计学差异，从7 天开始到21 天，正常对照组愈合情况明显优于糖尿病治疗组和糖尿病对照组(P＜0.05)；14 天开始，糖尿病治疗组愈合效率开始高于糖尿病对照组(P＜0.05)。
　　2.5 EGFP-BMSCs在胰腺、肾脏及溃疡局部的分布情况：细胞移植后14 天，糖尿病治疗组大鼠胰腺、肾脏及溃疡局部组织中出现Ad-EGFP标记的BMSCs细胞，提示BMSCs能定位于胰腺、肾脏及溃疡创面中，见图5～7。
　　
　　3结论
　　BMSCs是自我更新能力极强的一类具有多向分化潜能的非造血干细胞，其具有免疫原性低，取材方便，体外增殖能力较强的优势，且具有调节炎症介质、旁分泌生长因子类物质及良好的归巢作用[2-3]，大量的基础研究和初步临床试验结果肯定了BMSCs移植对缺血性心肌疾病、骨、软骨、角膜、皮肤及软组织再生的治疗作用。Ezquer[4-5]等在STZ诱导糖尿病小鼠体内静脉移植BMSCs的实验研究中也证实了BMSCs可明显改善小鼠高血糖症状、促进胰岛β细胞再生及阻止肾脏损害；同时发现从糖尿病小鼠体内分离培养的干细胞与正常小鼠干细胞相比，存在细胞表型改变、成骨不良及增殖潜能明显减退的现象，为BMSCs治疗糖尿病提供了进一步的理论支持。治疗糖尿病难愈性创面的动物实验研究表明，BMSCs移植后能分泌血管源性因子及分化为血管内皮细胞，进而促进毛细血管新生，加速创面愈合[6-7]；国外用自体BMSCs移植治疗糖尿病足溃疡的临床试验也显示了较好的促溃疡愈合效果[8]。
　　本研究给予实验动物低剂量STZ破坏了部分胰岛β细胞功能，配合高脂饲料可造成外周组织对胰岛素不敏感，两者结合便诱导出接近人类2型糖尿病的动物模型，且具有成模率高及死亡率低的优点，是一种简便可行的方法。创面愈合的过程是由细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同协同作用的复杂病理生理过程，分为相互重叠的4个时相：凝血期、炎症期、细胞增生期和修复塑行期。由于糖尿病患者血糖持续在较高水平，非酶促糖基化反应加速晚期糖基化终产物蓄积，使机体内环境协调功能障碍，导致创面长期难以愈合[9]；而在临床实践中，糖尿病溃疡多发生于足部，且截肢风险高，故本实验选择糖尿病足部溃疡大鼠模型，以观察静脉移植BMSCs能否在溃疡局部示踪及是否具有促愈合作用。
　　本实验结果显示BMSCs可以定位于糖尿病大鼠胰腺、肾脏及皮肤溃疡面，并在明显降低糖尿病大鼠血糖及改善消瘦症状的同时，加速足部溃疡的愈合；细胞移植后大鼠血糖虽未降至正常水平，溃疡愈合效果也不及正常对照组大鼠，但与糖尿病空白对照组相比有一定效果。表明BMSCs具有归巢特性，可能对糖尿病具有一定的治疗效果，治疗机制可能是BMSCs归巢后的旁分泌及定向分化潜能，仍待进一步研究。
　　因STZ是通过破坏胰岛β细胞功能而致糖尿病，因此胰腺组织破坏最严重，高表达许多种趋化因子，诱使BMSCs 向着胰腺归巢；糖尿病往往伴随有肾脏的损害，故肾脏组织也可见到干细胞归巢现象。糖尿病患者下肢动脉慢性闭塞，形成的溃疡因组织缺血缺氧而迁延不愈，静脉给药对于下肢血流尚通畅的还有一定效果，对于下肢血流阻塞的效果却不理想。该实验在2型糖尿病模型造模成功后1周即开始给予静脉BMSCs移植治疗，下肢微血管病变尚未形成血流完全闭塞的情况，故静脉移植细胞后在溃疡局部可见BMSCs. 然而，就干细胞是因为降低血糖才促进创面愈合的，还是直接的促创面愈合机制，有待进一步研究。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2011-06-11 [修回日期]2011-08-14
　　编辑/张惠娟