白细胞介素－１０对人牙囊细胞ＲＡＮＫＬ表达的影响|白细胞介素2由什么细胞

　　[摘要]目的：研究人牙囊细胞白细胞介素－10(interleukin－10，IL－1O)蛋白的表达及其对破骨细胞分化因子(receptor act．-vator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)表达的影响。方法：采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞，进行IL－10免疫组化染色。25ng／mlIL-10作用于牙囊细胞O、1、3、6 h，用RT―PeR检测RANKL mRNA表达的变化。结果：人牙囊细胞IL－1O表达阳性。25ng／ml IL-1O降低人牙囊细胞RANKL的表达，且具有时间依赖性。结论：人牙囊细胞表达IL－10，IL－10通过降低人牙囊细胞RANKL的表达，在牙齿萌出过程中起重要的调控作用。
　　[关键词]人牙囊细胞；白细胞介素－1O；破骨细胞分化因子
　　[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)02一02 34―03
　　牙囊是一层包绕未萌出牙齿的纤维囊性结缔组织，牙囊细胞通过参与破骨作用使牙槽骨吸收，进而形成牙齿萌出道，在牙齿萌出过程中发挥着关键作用。这一过程受到许多因子的调控，其中骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和破骨细胞分化因子(RANKIJ)是直接控制破骨细胞形成和分化的功能因子。白细胞介素10(IL-IO)是一种炎症抑制因子，具有抑制破骨的作用。研究表明它能够抑制牙槽骨的破骨细胞性骨吸收。本实验研究体外培养的人牙囊细胞IL-IO蛋白的表达及其对RANKL表达的影响，进一步探讨牙齿萌出的机制。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1．1实验材料：DMEM培养液(Hyclone，uSA)，胎牛血清(Gibco，USA)，兔抗人IL-10多克隆抗体(Santa Cruz，USA)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz，USA)，IL-IO(Pepro Tech，USA)，TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，逆转录试剂盒(Invitrogen，USA)。
　　1．2人牙囊细胞的体外培养与鉴定：取12～16岁因正畸需要拔除的下颌第三磨牙的牙囊组织，采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞。细胞抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，表明细胞来源于外胚问充质，无牙源性上皮混杂。取第5代人牙囊细胞进行实验。
　　1．3人牙囊细胞中IL-IO的免疫组化染色：取生长状态良好的第5代人牙囊细胞进行爬片。细胞爬片用4％多聚甲醛固定lOmin，然后用PBS振洗5min×3次。0．3％的TritonX-100滴在爬片上lOmin，增加细胞通透性；然后滴加3％H202 lOmin，阻断内源性过氧化物酶；滴加10％羊血清封闭30min；不洗，滴加兔抗人IL-IO多克隆抗体后置入湿盒4℃过夜，空白对照组滴加PBS；次日在37℃温箱复温1h，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体，置入37℃温箱lh；以上每步之后用PBS振洗5min×3次，然后DAB显色5～l0min。苏木素复染，逐级脱水，透明，中性树胶封片。
　　1．4RT-PCR检测IL－10对人牙囊细胞RANKL表达的影响：取生长状态良好的第5代人牙囊细胞，在终浓度为25ng／m1 IL-IO作用下分别于0、1、3、6h收获细胞。用TRIzol Reagent提取细胞总RNA。取2℃总RNA用逆转录试剂盒完成cDNA第一链的合成，然后进行PCR扩增。RANKL引物序列：上游引物：5’GGCTCATGGTTAGATCTGGC-3’： 下游引物：5’TGACCAATACTTGGTGCTTCC-3’；该引物产生351bp的eDNA片段。GAPDH引物序列：上游引物：5’GCTCTCCAGAACATCTACC-3’；下游引物：5’GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’；该引物产生266bp的eDNA片段。引物由上海生物工程公司合成。反应条件为：RANKL 94℃预变性2min：94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸lOmin。GAPDH 94℃ C预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸lOmin。PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察，凝胶图像分析系统成像。计算RANKL与GAPDH的灰度值之比，用来评定RANKL的相对表达量。以上实验重复进行3次。统计分析采用SPSSIO．0软件进行单因素方差分析(P＜O．05)，认为有显著性差异。
　　
　　2结果
　　
　　2．1人牙囊细胞中IL-IO的表达：人牙囊细胞中IL―10表达阳性，胞质呈棕褐色，空白对照组表达阴性(如图1)。
　　2．2 IL-IO对人牙囊细胞RANKL表达的影响：PCR产物测序结果与基因库中公布的RANKL(NM003701)的序列100％一致。RANKL、GAPDH的扩增产物分别为351bp、266bp(如图2)。25ng／mlIL-IO作用于人牙囊细胞1、3、6 h，RANKL的表达均有显著性降低(P＜O．05)，即在6h的作用时间内，25ng／m1 IL-IO降低人牙囊细胞RANKL的表达，且具有时间依赖性(如图3)。
　　
　　3讨论
　　
　　IL-IO主要由Th2细胞、B细胞和单核细胞产生。有研究证实牙周膜细胞产生IL-IO[5~。本实验表明人牙囊细胞也产生IL-IO。Liu等发现大鼠牙囊细胞表达IL-IO，并且牙囊在大鼠出生后牙齿萌出的l～9天时间内都表达IL-IO。这说明IL-IO参与了牙齿萌出的过程。Al-Rasheed报道IL-IO基因敲除小鼠的牙槽骨吸收加速。IL-IO可以抑制牙槽骨的破骨细胞性骨吸收。
　　OPG和RANKL是调控骨代谢的两种重要因子。人牙囊细胞表达0PG和RANKL。RANKL是一种膜结合蛋白，属肿瘤坏死因子超家族成员，存在于骨髓基质细胞和成骨细胞表面。它的跨膜信号受体是破骨细胞前体细胞表面的RANK。成骨细胞表面的RANKL与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合，使破骨细胞分化和激活，形成破骨细胞性骨吸收。RANK-RANKL途径被认为是在破骨作用发生的过程中起关键作用的途径，牙齿萌出时在牙槽骨中发生的破骨作用也是通过这一途径进行的。研究表明，缺乏RANKL基因的小鼠全身缺乏破骨细胞，牙齿不萌出。OPG属肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一种分泌型糖蛋白，由成骨细胞合成。OPG作为RANKL的饵受体，竞争性地结合RANKL，使RANKL不能与RANK结合，阻断RANK-RANKL途径，抑制破骨细胞性骨吸收。
　　本实验进一步表明：IL-IO降低人牙囊细胞RANKL的表达，因此在牙齿萌出过程中对牙槽骨的吸收发挥抑制作用。从细胞和分子水平研究大鼠牙齿萌出的过程中发现，大鼠出生后9～11天RAN-KL升高，除此时期外RANKL都保持较低水平。研究还发现，大鼠牙齿萌出的特定时期是在出生后第3天和第10天。大鼠出生后第3天，第一磨牙牙囊中单核细胞数量达到峰值，牙齿周围的牙槽骨中破骨细胞数量也最多，破骨作用最强，导致牙槽骨吸收，牙齿萌出。虽然此时RANKL保持较低水平，但OPG降低较多，使RANKL／0PG比值增加，牙槽骨发生破骨细胞性骨吸收。第3天以后OPG表达增加，RANKL仍然保持较低水平，RANKL／0PG比值降低，牙槽骨吸收受抑制。大鼠出生后第10天，破骨细胞数量较多，破骨作用较强，此时RANKL升高，虽然OPG水平较高，但RANKL／0PG比值增加，牙槽骨也发生破骨细胞性骨吸收，牙齿萌出。第10天牙槽骨的破骨细胞性骨吸收强度低于第3天。这说明正常牙齿萌出的过程中存在牙齿萌出的特定时期和非牙齿萌出的特定时期，在非牙齿萌出的特定时期牙槽骨吸收受到抑制。IL-IO可以通过降低RANKL的表达抑制牙槽骨的破骨细胞性骨吸收，在非牙齿萌出的特定时期发挥作用，而且IL-IO自身也能抑制破骨细胞性骨吸收，这样可以保证在非牙齿萌出的特定时期牙槽骨保持正常状态。
　　本实验首次证实人牙囊细胞产生IL-IO，IL-IO通过降低人牙囊细胞RANKL的表达，在牙齿萌出过程中起重要的调控作用，为进一步研究牙齿萌出机制打下基础。
　　编辑／何志斌
　　(注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。)