【人脂肪间充质干细胞冻存方法的改进】 间充质干细胞的来源

　　[摘要]目的：探索理想的冷冻人脂肪间充质干细胞的方法。 方法：采用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞，消化细胞并洗涤离心加入10％二甲基亚砜、30％胎牛血清、60％MEM的细胞冻存体系，直接置-70℃冰箱贮存。冻存4、8和12周后，37℃水浴复温，通过检测细胞周期细胞表型和成脂的多向分化潜能，以鉴定该方法的可行性。结果：消化后不经过传统的程序性降温冻存技术，直接在-70℃冰箱赡存，其细胞生物学特性无明显改变，细胞仍存在成脂的多向分化潜能。结论：人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生：物学特性，是冷冻保存的一种可行方法。
　　[关键词]人脂肪间充质干细胞；分化；脂肪细胞；冷冻贮存
　　人脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下，可以分化为成骨、软骨、脂肪等多种细胞，是组织工程，尤其是骨或软骨组织损伤修复中重要的种子细胞。因此，对其体外分离培养、扩增及保存方法等研究具有重要的意义。人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到实验用的数量一般需要3剧左右。我们在工作中发现，人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。为保证实验的连续性，随时提供大量的实验或组织工稗用的种子细胞，建立～种行之有效的方法是必要的，通过检测人脂肪间充质干细胞在冻存复苏后的细胞周期，细胞表型和成脂的多向分化潜能来鉴定冻存方法的可靠性。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　人脂肪间充质干细胞的分离纯化及培养：脂肪组织来源于兰州军区兰州总医院美容中心行脂肪抽吸术的患者，身体健康。无菌条件下，在局部肿胀麻醉下采用注射器法抽取50ml脂肪组织，静置半小时，去除上清液体，获得纯度较高的脂肪颗粒，用等容的D-Hank’s平衡盐液清洗4次，去除细胞碎片。然后用150ml HBSS(含0.075％胶原酶I)，在37℃，振动消化1h。胶原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后离心1200r，10min。细胞被悬浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目筛网过滤。离心后，细胞悬浮在培养基中。加至培养瓶，37℃，C0孵箱中培养24h，未贴壁的细胞和残渣被除掉，新鲜培养液加至贴壁细胞。细胞培养至80％融合时，用胰酶／EDTA消化和按1:1的比例传代。
　　
　　1．2　人脂肪间充质干细胞的冷冻保存及复苏：取原代或扩增培养的人脂肪间充质干细胞的培养瓶吸弃培养体系，胰酶／EDTA消化，加PBS洗涤后加入现配的含10％DMSO、30％胎牛血清的MFM的冻存体系，按12ml／瓶将瓶底面积铺满，密封瓶口，用包裹两层，平整存放于至-70℃低温冰箱。存不同时间后，取出含细胞的培养瓶，放入水温38℃～40℃的恒温水浴箱快速解冻。此时操作应避免剧烈晃动，以免使细胞损伤，待冰块基本融化后弃上清，用PBS洗涤2次，加入MEM的培养体系，37℃培养箱内培养。需要注意的是，细胞冻存体系必须配制后再加入细胞中，各种成分不能单独加入，并且冻存的细胞尽可能短时间存放在液体状态下的冻存体系中。

　　　　
　　1．3　冻存前后人脂肪间充质干细胞表面标志的鉴定：培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min,5min)后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为1×10／L，分别于人抗CD34、CD44、CD45、CE108、CD49d和HLA－DR单克隆抗体室温反应30min，PBS洗涤2次后于FITC标记的二抗避光作用30min。用PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
　　
　　1．4　冻存前后人脂肪间充质干细胞细胞周期的测定：培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min，5min)，调整细胞浓度至1×10／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNaseA处理30min，PI染色10min。用Cellquest软件获取10000个细胞，ModiFit分析细胞周期。
　　
　　1．5　人脂肪间充质干细胞多向分化的诱导：取冻存前后的人脂肪间充质干细胞，脂肪细胞的诱导：细胞以2×10细胞／孔接种于6孔培养板，其中含有1μmol／L的地塞米松、0.5mmol／L的甲基黄嘌呤异丁酯、100mmol,／L的消炎痛、10％的胎牛血清DMEM(试剂均为终浓度，SIGMA公刮产品)。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　人脂肪间充质干细胞的分离纯化、扩增培养及形态特征：倒置生物显微镜下观察，接种后48h，极少数细胞贴壁，呈梭形，4天后细胞呈纤维集落样生长，大约8～10天，细胞迅速生长并形成克隆，2周左右细胞近80％～90％汇合，出现致密的贴壁层。继续培养，可见有自发分化的现象出现不典型的聚集的小脂泡。
　　
　　2．2　人脂肪间充质干细胞的表型特征流式细胞仪检测结果显示：脂肪千细胞均一的表达CD44、CD106阳性，而CD34、CD45、CD49d和HLA－DR呈阴性表达。CD49d和CD106是脂肪干细胞和骨髓干细胞的很好的区分标记。冷冻前后的表型鉴定无明显区别。
　　
　　2．3　冷冻保存后的人脂肪间充质干细胞存活率及细胞周期的变化：分别将在-70℃低温冰箱冻存4周、8周和12周的细胞38℃～40℃水浴中复苏，直接计数活细胞。次日收获人脂肪间充质干细胞流式细胞仪测定细胞周期，冻存后细胞周期分析结果显示：我们分离培养的细胞处于G／G1期，仅少数细胞处于活跃的增殖期与冻存前比较没有明显的变化。倒置生物显微镜下观察细胞形态，与冻存前比较没有明显形态的区别，并且冻存4、8、12周的细胞形态之间没有明显差别。实验结果证实，-70℃冻存的人脂肪间充质干细胞不会明显改变细胞的细胞周期特点。从本研究的结果来看，冻存前的贴壁细胞应以70％～80％长满为宜，复苏后基本完全存活。
　　
　　2．4　冻存复苏的人脂肪间充质干细胞的诱导分化：冻存12周后复苏细胞，检测细胞多向分化能力。用腊肪诱导体系诱导1周后即有60％～80％的细胞内出现脂肪滴，用油红染色后在胞浆内出现密集的红色颗粒。当诱导12天时，100％的细胞出现油红染色阳性反应。
　　
　　3　讨论
　　
　　Zuk等的研究建立了人脂肪间充质干细胞分离培养的方法。自此，有关人脂肪间充质干细胞的研究逐渐深入。我们以往的工作分析了人脂肪间充质干细胞的细胞生物学特性，并证实其可以分化为成骨、脂肪等细胞。但是我们发现，细胞在传代过程中，其细胞形态会发生改变，增殖变缓。甚至细胞发生自发分化现象。为了解决这个问题，并给以后的人脂肪间充质干细胞临床应用提供有效数量的种子细胞，我们摸索改进了人脂肪间充质干细胞的冷冻保存方法。
　　在传统的细胞冻存方法中，一种是程序性降温冻存法，另一种则是非程序性降温冻存法，其中包括-80℃～-196℃两步法和直接-80℃一步法常规的程序性降温液氮冻存法，其步骤复杂费时，而且需购置费用昂贵的专用仪器。20世纪80年代Till等采用HES／DMSO作为冷冻保护剂，以非程序降温-80℃冰箱冻存外周血干细胞获得成功。我们利用DMSO作为冷冻保护剂，探索在70℃冰箱内以非程序降温冻存消化后的人脂肪问充质干细胞。经过低温冷冻保存后的细胞经3代传代，细胞表型和分化潜能不发生明显改变。解冻后的细胞存活率很高。可见，人脂肪间充质干细胞在-70℃冰箱内短期冷冻保存是一种可行的方法。依据实验结果我们认为，冻存方法的关键在于选择合适的冷冻细胞密度，这是保证细胞冻存效果的重要条件。细胞密度太小，细胞之间没有连接，增殖速度会很缓慢。但是如果密度过大，复苏后的细胞增殖没有适当的空间使贴壁细胞容易脱落。此外，在人脂肪间充质干细胞的培养工作中我们还发现，过密的贴壁细胞易造成人脂肪间充质干细胞向成纤维细胞分化而使其失去干细胞的特性，表现为细胞增殖缓慢，传代次数减少。因此，-70℃冰箱内细胞冻存法可以概括为如下优点：①缩短了冻存步骤，短期内并没有改变细胞的生物学特性；②低温冰箱冻存细胞不需要液氮及液氮冻存装置，降低了细胞的冻存成本；③方法简便快捷、易操作，能较快地扩增足量的细胞，大大缩短了培养时间。本研究为人脂肪间充质干细胞的基础和应用研究提供了保证。