【软骨组织工程研究进展】组织工程软骨

　　软骨组织工程的基本原理是从机体获取少量活组织,将功能细胞从组织中分离出来,并在体外进行培养、扩增,然后与可降解吸收的支架材料按一定比例混合,植入病损部位,生物材料在体内逐渐降解和吸收,植入细胞在体内增殖和分泌ECM,最后形成所需的组织或器官,以达到创伤修复和功能重建的目的[1]。目前软骨组织工程的研究内容主要集中在以下几个方面:①种子细胞;②支架材料;③细胞因子;④基因修饰。本文就软骨组织工程的研究现状及其进展作一综述。
　　
　　1 软骨种子细胞
　　理想的软骨种子细胞应具有以下特点:①取材方便,对机体创伤小;②植入受体后对机体免疫排斥反应小;③在体外培养时有较强的增殖能力;④能稳定保持软骨细胞表型。
　　1.1软骨种子细胞来源:目前,报道的软骨组织工程种子细胞主要包括:自体软骨细胞、异体软骨细胞、基因修饰的永生化软骨细胞及各种来源的干细胞。
　　1.1.1自体软骨细胞:软骨细胞是终末分化细胞,可以合成ECM,如Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合物等,是组织工程软骨研究最早,也最常采用的软骨种子细胞,通过胶原酶直接消化关节软骨、骺板软骨、肋软骨和耳软骨组织等获得[2]。自体软骨细胞来源的种子细胞不存在免疫排斥反应,有利于临床应用。但自体软骨细胞体外培养传代会发生“去分(dedifferentiation) 化”现象[3] ,丧失增殖和分泌基质的能力,生长缓慢,不能达到组织工程软骨的需要数量。且取自患者来源有限、对个体造成二次创伤、增加了手术费用和患者痛苦等,这严重限制了其作为种子细胞的应用。
　　1.1.2 异种和同种异体软骨细胞:异种软骨细胞来源充足,短时间可大量获取、增殖,但植入受体后免疫排斥反应严重,故应用较少。虽然该类种子细胞也存在免疫反应,但随着移植时间推移其免疫反应逐渐减弱,并且随着免疫抑制剂研究的快速发展,较严重的免疫反应已基本消除。然而,该软骨细胞来源于其他健康个体,在获取的同时又对其他个体造成创伤,增加二次手术费用,故也不是最理想的软骨种子细胞来源。
　　1.1.3 干细胞在体外培养时可无限分裂增殖并保持其多分化潜能,且干细胞源性的软骨细胞具有获得稳定表型的优点[4]。目前体外证实具有软骨分化潜能的干细胞包括:①骨髓来源的间充质干细胞;②脂肪来源的间充质干细胞;③胚胎干细胞;④其他来源的间充质干细胞。
　　1.1.3.1 骨髓来源的间充质干细胞:1976年,Friedenstein[5]将利用骨髓贴壁培养的方法分离的具有多向分化的细胞命名为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。骨髓可取自骨干、髂骨、肋骨,来源相对充足,获取方法简便易行。BMSCs在诱导因子作用下可向软骨细胞分化,已被公认有可能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。目前,用于BMSCs 分离的方法主要有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选法和细胞筛选法,以Ⅰ型胶原凝胶为载体材料复合骨髓MSCs修复全骺软骨缺损,证实正常关节软骨形成。活体实验表明,诱导分化的软骨细胞植入体内可获得软骨缺损的修复[6]。
　　1.1.3.2 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs):主要来源于受精卵发育成的早期胚胎,也可从体细胞核移植发育的胚胎获得。是胚胎发育早期胚泡内细胞团中未分化的细胞,具有以下特点:①具有受精卵的某些特性,可多向分化、无限增殖,可以分化成胎儿和成体内各种类型的组织细胞;②可以在体外增殖并保持未分化二倍体的状态,具有全能性和形成嵌合体动物的能力;③可以在体外培养条件下建立稳定的细胞系,长期培养并保持未分化二倍体的状态,具有全能性和形成嵌合体动物的能力;③可以在体外培养条件下建立稳定的细胞系,长期培养并保持高度未分化状态和发育潜能性。因此, 胚胎干细胞有望成为软骨组织工程中新的种子细胞的理想来源。自上世纪80年代初,有学者[7]利用早期胚胎的内细胞团或上胚层细胞建立ESCs系后,Kramer等研究证实ESCs在BMP-2及BMP-4作用下可分化为软骨细胞。
　　1.1.3.3 脂肪来源的间充质干细胞:2001年,Zuk等[8]从人吸脂术抽取的脂肪组织悬液中,第一次分离取得了多向分化干细胞, 命名为processed lipoaspirate (PLA)。Ogawa 等[9]将脂肪干细胞传代2次后,加入软骨诱导DMEM培养液,应用微球培养的方法培养4周,可以检测到aggrecan和coI-Ⅱ、coI-X等基因表达,组织学染色可以发现阿丽辛蓝(alcianblue)染色阳性细胞,这些都证明脂肪干细胞可以向软骨细胞分化。因ADSCs 来源充足、获取方便、对培养基的要求低、体外扩增能力强等优点,引起了学者们的广泛关注,目前分离常用贴壁筛选法。
　　1.1.3.4 人脐带间充质干细胞:大量研究表明脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,它在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。侯克东等[10]研究发现人脐带MSCs具有向软骨自然分化的特点。此外脐带MSCs天然表达Sox-9和Col-2A1,其中Sox-9基因能够结合软骨细胞特征性的Ⅱ型胶原、aggrecan 蛋白增强子基因使其活化表达,对于软骨的分化、发育、调控起着重要作用,从分子水平揭示了人脐带MSCs 具有与软骨细胞相似的特性,表明它可能更适合于构建工程软骨组织。
　　1.1.3.5 其他来源的间充质干细胞:其他来源的间充质干细胞在软骨组织工程方面的应用也被诸多学者加以研究,其他来源的间充质干细胞在软骨组织工程方面的应用也被诸多学者加以研究,如Nawata 等[11]用取自第19天的胎鼠大腿的肌肉源性基质干细胞诱导成了成熟的软骨;Fuchs等[12]以羊脐血干细胞构建出了与天然软骨具有相似组织学特性的三维软骨。Waki-tani等[13]培养兔胫骨膜细胞,修复兔股骨髁全层软骨缺损,24周时软骨下骨完全形成,新生软骨组织无骨化现象。目前,国内尚有学者对外周血来源的干细胞在软骨方面的分化加以研究。
　　1.1.3.6 BMSCs与软骨细胞共培养:基于BMSCs和软骨细胞均不能完全满足组织工程对种子细胞的要求,那么将两种细胞优势互补,进行共培养来优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源就成为可供选择的方式。周广东等[14]将软骨细胞与BMSCs混合培养,能诱导BMSCs在体内非软骨形成部位向软骨分化,并形成软骨组织,整个过程无需另外添加细胞因子。因此,BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。
　　
　　2支架材料
　　生物支架材料不仅提供软骨细胞生长依附的空间架构、力学需求和几何形状, 更重要的是它作为细胞外基质之一,可以协调生物活性因子和细胞之间的相互作用,增进细胞的附着,潜在地影响细胞表面因子受体的表达和细胞的分化。
　　2.1 根据支架空间结构的不同,可分为二维支架和三维支架。大量实验证明,在二维支架平面培养的条件下,软骨细胞易受细胞接触抑制的影响,出现去分化,表现为成纤维细胞样形态学改变,不能表达特定的软骨蛋白,如Ⅱ型胶原、氨基葡聚糖等,而大量表达Ⅰ型胶原[15]。在三维支架培养的条件下,三维环境更近似体内微环境,软骨细胞可以再分化,表达Ⅱ型胶原,合成ECM。
　　2.2 按其应用形态可分为:凝胶类、微球类、海绵类及人工高分子聚合物支架材料。
　　2.3 支架根据生物材料的差异,可分为天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料[16]。
　　2.3.1 天然生物材料:主要包括胶原、明胶、纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺多糖( 如:透明质酸、硫酸软骨素等) 、藻酸盐、蚕丝蛋白[17]、几丁质、松质骨骨基质、脱细胞基质等,天然生物支架材料来源于生物体本身,具有组织相容性较好,毒性较小,易降解,且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点,所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。
　　2.3.2 人工合成高分子材料:人工合成高分子材料的微结构、机械性能以及材料的降解时间等都可以预先设计和调控,包括有机合成材料和无机合成材料。无机材料以羟基磷灰石、磷酸三钙为代表,有机材料以聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基乙酸/聚乳酸复合物(PLGA)、聚己内酯、聚环氧乙烯、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等高分子聚合物为主。人工合成材料不受来源的限制,容易加工成形,可根据需要调整物理、化学、生物力学和降解性能。生长因子和其他一些药物刺激因子可以涂于支架上面以刺激细胞进行增殖和分化。但是在运用中也发现了不少缺点,如其亲水性不够,对细胞的粘附性较弱,降解产物偏酸性可引起炎症反应等,并且有一定的免疫原性[18]。
　　2.3.3 复合材料:复合材料是目前研究的热点, 即将两种或两种以上具有互补特征的生物相容性可降解材料按一定比例和方式组合,可设计出结构与性能优化的三维材料,以弥补单用人工合成或天然生物材料的缺陷。复合材料的制备不仅包括同一类生物材料的复合,还包括不同类别生物材料之间的交叉复合。目前主要有:天然生物材料之间的复合、人工合成高分子材料之间的复合、天然生物材料与人工合成高分子材料之间的交叉复合。
　　2.4 根据支架制作的特征,可将支架分为预制支架和可注射型支架两类。可注射型支架具有微创的优点,并能为细胞的增殖与分化提供更为接近于天然细胞外基质的化学和物理环境。目前可注射型支架是以水凝胶为基础,常用的有纤维蛋白凝胶、藻酸钙凝胶、透明质酸、聚氧化乙烯酸、二甲基丙烯、聚丙烯延胡索酸复合乙烯凝胶、聚氧化丙烯等。
　　2.5 纳米材料:纳米材料由于结构上的特殊性,具有一些独特效应,如表面效应和体积效应等。它主要是支架材料制作技术上的创新,而非新出现的物质。纳米尺寸的粗糙表面能够适度地调控细胞粘附、增殖、分化和凋亡。Hong等[19]研究提示羟基磷灰石(HAP)纳米微粒的加入有助于软骨细胞在支架上的粘附和扩增,也可提高材料的生物相容性。
　　
　　3细胞因子
　　对软骨种子细胞有明显调节作用的细胞因子主要有转化生长因子-β( transforming growth factorβ, TGF-β)、骨形态发生蛋白( bone morphogenetic p roctein, BMP)、胰岛素样生长因子( insulin-like growth factor, IGF)、成纤维细胞生成因子( fibroblast growth factor, FGF) 、肿瘤坏死因子( tumour necrosis factor, TNF)、甲状旁腺激素相关蛋白( trFHrP)、肝细胞生长因子( hepatocyte growth factor, HGF)以及近几年新发现的软骨调节素( chondromodulin)等[20]。
　　3.1 转化生长因子:转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一种细胞生长和细胞外基质合成的多功能调节器,它可以促进软骨细胞增殖,增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成。可能通过增强软骨转录因子Sox9 的表达,促进细胞聚集,达到软骨分化的必需条件。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及TGF-β4 4种形式[21]。TGF-β1 是诱导BMSCs向软骨细胞分化的主要细胞因子,能刺激软骨细胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,并保持软骨细胞表型稳定。TGF-β2 的生物学功能与TGF-β1相似, 对软骨和成骨分化具有调节作用。TGF-β2 通过调节甲状旁腺激素相关蛋白的分泌,促进软骨细胞分化成熟[22]。TGF-β3 是T促软骨形成的重要细胞因子,它通过增强Sox9 表达,促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原合成[23]。Goessler 等[24] 报道TGF-β4 基因在软骨去分化过程中表达,提示其在软骨去分化过程中发挥作用。
　　3.2 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic p roctein,BMP):骨形态发生蛋白家族成员有40多个,其中BMP-2、BMP-3、BMP-7与软骨组织的形成和修复密切相关。BMP可以刺激MSCs向软骨细胞分化,并能较长时间地维持软骨细胞表型[25]。根据序列同源性分析,可分为几个亚群,其中属于BMP-2/ BMP-4 亚群和成骨蛋白1(osteogenic protein 1,OP-1) 亚群的BMP,大多数能在体内诱导骨及软骨形成。
　　3.3 胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF):IGF-1在软骨发育过程中可促进软骨基质合成,刺激增殖,调节细胞程序性死亡,诱导软骨细胞表面标记物的表达[26-27]。Longobardi 等[27] 发现IGF-1 刺激软骨形成是独立于TGF-β信号系统,本身具有强大诱导软骨分化的潜力,与TGF-β1 合用有协同效应。
　　3.4 血小板源性生长因子(PDGF):血小板源性生长因子最初被认为是纤维细胞生长的促进因子,血浆中大量存在, 但细胞浆内微量存在。现在发现还具有促进结缔组织、胶质与平滑肌细胞的增殖等功能[28]。
　　3.5 成纤维细胞生成因子:由多种不同结构的相关多肽组成,碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)是有代表性的细胞因子,单独应用bFGF作用于体外培养的单层软骨细胞,可强烈刺激软骨细胞增殖,并维持细胞表型[29]。
　　3.6 软骨调节素(ChM):软骨调节素(chondromodulin)是一组软骨特异性生长因子,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种。Hiraki等[30]证实并克隆了25KD的糖蛋白chondromodulin-1,并报道了它的结构和生物学活性。ChM21在体内和体外均能够刺激软骨细胞培养体系中软骨细胞的生长及集落形成,并抑制新生组织血管形成的作用。
　　
　　4基因修饰
　　多种细胞因子有促进软骨修复的作用。通过基因重组技术,将细胞因子基因导入软骨细胞或相关细胞,使之在病损部位分泌生长因子并维持所需的浓度和时间,有效促进软骨的修复,这就是基因修饰的组织工程技术(gene modified technology)。与外源性给予生物因子相比,内源性诱导的生物活性因子表达更加稳定、持久及可靠。
　　4.1软骨组织工程中转染的目的基因主要有:TGF-β因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白因子、Sox9、bFGF、TNF受体、IL-10、IL-4、IL-3 等[31],对种子细胞增殖、分化具有重要影响的生物活性因子基因。
　　4.2 基因转染载体:载体是基因修饰的关键,目前基因转染载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒等,非病毒载体包括脂质体、FuGene6。
　　4.3 基因治疗的方法分为:直接转移技术、间接转移技术。直接转移技术的常用手段有组织内直接注射质粒DNA、重组病毒载体等,主要缺点是基因表达期相对短暂,转基因效率低。间接转移技术是从患者体内收集靶细胞,体外培养,经过体外基因转染后,再重新用于患者体内,可以避免病毒载体的危害,但操作较复杂,需具备良好的组织细胞培养技术和再植入技术[32]。
　　
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　　[收稿日期]2010-02-23 [修回日期]2010-04-07
　　编辑/李阳利