三羟基异黄酮诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及其机制研究 成纤维细胞名词解释

　　[摘要]目的：探讨三羟基异黄酮(Geni stein)诱导体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及相关机制。方法：体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞，不同浓度Geni stein作用后，MTT比色法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，We stern Blot法检测细胞Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表达。结果：在6eni stein作用下，增生性瘢痕成纤维细胞的生长受到抑制；细胞凋亡率增加，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)；Bcl－2的表达下调、Bax、Caspase－3表达增加。结论：Geni stein可通过诱导凋亡抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，其作用机制可能与影响Bcl－2、Bax、Caspa se－3等凋亡调控基因的表达有关。
　　[关键词]三羟基异黄酮；增生性瘢痕：凋亡；Bcl－2；Bax；Caspase－3
　　[中图分类号]Q813.1　[文献标识码]A　[文章编号]l008－6455(2007)05－0600－03
　　
　　对增生性瘢痕(hyperplastic scar，Hs)防治的研究仍是医学界的难题，目前尚未找到理想的治疗约物。研究表明，成纤维细胞的增殖与凋亡之间的失衡与病理性瘢痕的形成具有密切关系，通过对成纤维细胞凋亡的诱导可有效抑制瘢痕增生从而达到治疗瘢痕的作用。5，7，4’一三羟基异黄酮(Genistein)是来源可豆类的植物雌激素类化合物，研究表明其对多种恶性肿瘤细胞具有诱导凋亡、抑制生长的作用，对组织器官纤维化也有一定的治疗效果。本实验研究Genistein对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用并探讨其可能机制，为临床应用Genistein治疗病理性瘢痕提供实验依据。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1.1　主要仪器：YJ－875型超净上作台(苏州净化设备公司)、1815TC型二氧化碳培养箱(美国SHEL－LAB)、550型酶标仪(美国BIO－RAD)、FACS Caliber流式细胞仪(美国Bencton Dickinson)、Mini－PROTEAN型电泳槽(美国Bio－Rad)、Gel Doc2000型凝胶成像系统(美国Bio－Rad)。
　　
　　1.2　主要试剂：5，7，4’一三羟基异黄酮(Sigma，美国)、DMEM细胞培养基(Hyclone，美国)、四甲基偶氮唑蓝(rrT)(Sigma，美国)、碘化丙啶(PI)(sigma，美国)、小鼠人Bcl－2单克隆抗体(Santa Cruz，美国)、小鼠抗人Bax单克隆抗体(Santa Cruz，美国)、小鼠抗人Caspase－3单克隆抗体(santaCruz，美国)、Western blotting检测试剂盒(武汉博士德公司)。
　　
　　1.3　细胞培养和分组处理：采用组织块法行瘢痕成纤维细胞原代培养(增生性瘢痕组织来源于本院6例深II度烧伤后5～8月瘢痕患者手术所取标本，瘢痕外观充血发红、质硬，高于皮面1cm以上，处于增生活跃期；局部无感染和溃疡；未使用过激素类药物、抗肿瘤药物以及未曾接受放射治疗者)，培养体系为DMEM培养液(含体积分数10％的新生小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)。将瘢痕切成1mm3大小组织块置于培养瓶中，在5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6～8h，待组织块贴壁后加入DMEM培养基继续培养；原代细胞生长成单层后，每4～5天分种传代1次，实验用第3～5代细胞。将处于对数生长期的细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液接种于96孔平面培养板中，调整细胞数为2.5×104/ml，每孔细胞悬液200ul。实验组分别加入DMSO配制终浓度为25umol/L、50umol/L、100umol/L的Geni stein；对照组只加同体积的DMSO；各组设3个复孔，继续培养48h。
　　
　　1.4　MTT法检测细胞增殖：分别于每孔加入0.5％MTT溶液20ul，37℃继续培养4h，小心吸弃上清，每孔加入150ul DMSO震荡15min，振荡待紫蓝色结晶完全溶解，以酶标仪在490nm波长检测各孔的光密度值(OD值)。
　　
　　1.5　流式细胞分析测定细胞凋亡：用PBS冲洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化分离细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，70％冷乙醇固定，PBS离心洗涤三次，加入lml PBS及RNA酶A5ul，37℃作用30min，加入碘化丙啶(PI)在4℃染色30min，进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。
　　
　　1.6　 Western Blot蛋白免疫印迹法测定细胞Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表达：常规收集各组细胞，加入预冷的NP－40细胞裂解液冰上静置30min裂解细胞，4℃振荡离心，收集上清，Lowry法测定蛋白含量。加适量上样缓冲液100℃热变性5min，取100ug总蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳；再将凝胶中的蛋白质低温电转移至硝酸纤维素膜；按Western blotting试剂盒操作步骤分别加入一抗及FITC－TgG二抗讲行反应(内参照为β－actin蛋白)，用荧光成像分析系统采集蛋白电泳条带，Quangtity One软件分析计算得到蛋白表达指数EI。EI＝(目的蛋白条带面积×灰度)／(内参照蛋白条带面积×灰度)
　　
　　1.7　统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。
　　
　　2　结果
　　
　　2.1细胞增殖：各组Genistein处理后细胞的增殖均受到抑制，与对照组相比有显著性差异(P＜O.05)，随浓度的升高，抑制率增加，呈剂量一效应关系。100umol/L Genistein对细胞增殖的抑制作用与对照相比具有非常显著性的差异(P＜0.01)(表1)。
　　2.3　Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表达：样品蛋白经电泳后得到相应大小片段的产物，在显像系统下可见相应表达带(图1)，经内参标准化后得到各组蛋白表达指数(表3)。结果显示在Genistein作用下，Bcl－2蛋向的表达随6enistein浓度增加而减弱，而Bax及Caspase－3的表达逐渐增强，与对照相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　
　　3　讨论
　　
　　细胞凋亡(apoptosis)是一种多基因调控的程序性死亡过程，它是调控机体生长发育、维护内环境平衡的一种重要的自我调节机制。病理性瘢痕的发生与瘢痕成纤维细胞的异常增殖与凋亡不足有密切关系，促进细胞凋亡是治疗增生性瘢痕的有效手段。
　　细胞凋亡受多种凋亡相关基因编码的蛋白调 控，是多种促进因素和抑制因素共同作用的结果。凋亡调控基因包含两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因如Bcl－2，另一类为包含Bax、Caspase等在内的促细胞凋亡基冈。目前认为Bcl－2与Bax基因及其蛋白产物是最重要的凋亡调控因子，其比例的变化在诱发细胞凋亡的过程中具有中心性作用。Wassermann等的研究表明增生性瘢痕组织中Bcl－2蛋白的含量较正常皮肤升高，而Bax含量显著降低，说明瘢痕组织中凋亡抑制蛋白高表达而凋亡促进蛋白低表达或不表达，其引起的细胞凋广：受阻可能是增生性瘢痕形成的原因之一。Caspase－3是细胞另一重要的凋亡调控分了，也是细胞凋亡的重要标志，大量研究表明细胞凋亡过程是一个复杂的、由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。在一些外界刺激因素的作用下，Caspases－3活化，使一些处于静止状态的促凋亡因子被激活(如Caspase－6和PKCδ等)，而另外一些凋亡抑制因子(如Bcl－2)被灭活；部分维持细胞结构的物质(如肌动蛋白，核纤层蛋白等)被降解；一些与DNA损伤修复、RNA剪切、DNA转录相关的蛋白因子被裂解失活，细胞发生凋亡水解。增生性瘢痕组织中Caspase－3蛋白的阳性细胞率明显低于正常皮肤组织，因此其介导的细胞凋亡也可能因此随之降低，凋亡和增殖间的平衡被打破，最终引起肉芽组织过度增生，形成增生性瘢痕，说明Caspase－3参与了增生性瘢痕形成的调控。
　　Genistein是大豆异黄酮的主要成分，是一种特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂，能特异性阻断受体酪氨酸蛋白激酶及整合素等信号分子介导的蛋白酪氨酸激酶磷酸化，从而影响细胞的增殖和分化，可诱导肿瘤细胞凋亡而产生抑制作用。本研究检测Genistein对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及Bcl－2、Bax，Caspase－3的表达变化的影响，发现Genistein能显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，增加细胞凋亡率，进一步研究结果发现Bcl－2的表达随Genistein作用浓度增高而下降，而Bax，Caspase－3含量逐渐上升，与对照相比具有显著性差异。实验证实Genistein可通过诱导凋亡而产生对瘢痕细胞增殖的抑制，其凋亡的发生可能与影响Bcl－2、Bax、Caspase－3等凋亡调控基因的表达有关。Genistein作为一种抑制肿瘤增殖及组织纤维化的药物具有广阔的应用前景，但对其信号调节作用的具体过程和控制凋亡与增殖的机制还有待进一步的研究。
　　
　　编辑　张惠娟