[重组人ＶＥＧＦ基因对游离组织移植物血管形成的作用] 游离dna人人基因

　　[摘要]目的：研究重组人血管内皮生长因子（VEGF）基因对游离皮瓣、皮片及游离颗粒脂肪等移植物血管形成的作用。方法：将带有PCD-VEGF165的大肠杆菌接种到LB培养基中，通过碱分裂法制备PCD-VEGF165质粒，再用反蒸发法将质粒包埋于脂质体中。将108只雄性SD大鼠均分为三组，每组36只，每组再分三小组，分别为PCD-VEGF165目的基因组、PCD空白质粒组和生理盐水组，注入后在不同时间点取标本做成石蜡块行常规染色以观察血管生长情况。结果:三种移植组织中目的基因组微血管密度均显著高于其他两对照组（P0.05).ConclusionThe VEGF gene is stable ,special and enduring. And the angiogenesis and blood supply increased after it was injected in the free transplanted tissues.
　　Key words:vascular endothelial growth factor;angiogenesis;flap;graft;free pearl fat
　　
　　自体组织移植的成活率一直是整形外科医生十分关注的问题之一，而提高成活率需要解决的核心问题是移植组织的血供问题，对移植组织的血供影响最大的是血管内皮生长因子（VEGF）,它能选择性地促进血管内皮细胞分裂[1-3]，在血管发生和形成中起到重要的调节作用[4]。但是VEGF价格昂贵、在体内不稳定、半衰期短的特点限制了它在临床的应用。而外源性VEGF基因通过质粒导入机体细胞后具有生物活性稳定、特异性强、持续时间长的特点，表达的VEGF可以分泌出细胞而发挥作用。我们应用分子生物学的方法在构建PCD-VEGF165重组质粒，并将之直接作用于皮瓣、皮片及游离颗粒脂肪的局部，探讨它对移植组织中血管形成的作用及其机制。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 主要试验材料：PCD-VEGF165由华中科技大学同济医学院分子生物学实验室惠赠。限制性内切酶BamH I、EcoR I购自Gibco公司。鼠抗人VEGF单克隆抗体，生物素标记的多克隆抗小鼠IgG抗体及CD34单克隆抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Sprague-Dawley大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
　　1.2 PCD-VEGF165质粒的制备：将含有PCD-VEGF165质粒的大肠杆菌菌种接种到LB培养基中，通过碱裂解法大量提取质粒。用聚乙二醇纯化所提取的质粒，紫外线分光光度计定量，以了解所提取质粒的浓度和纯度。取少量的质粒用BamHI,EcoRI双酶切鉴定，以检测目的基因和载体。用反向蒸发法制备脂质体包埋重组质粒，形成PCD-VEGF165脂质体复合物。
　　1.3 动物试验：将108只大鼠平均分成三组，每组36只，分别为：皮片组、皮瓣组和游离脂肪组。每组内再分为三小组，每小组12只，分别为： PCD-VEGF165试验组、PCD空白对照组和生理盐水对照组。
　　1.3.1皮片组：在大鼠背部两侧各作一3cm×2cm大小皮片，保留完整的皮下血管网，将含VEGF基因的脂质体100μg稀释成1000μl,10等份，每个皮片内选择均匀分布的5个点各注射100μl,受区皮下分5点各注射100μl,对照组同样方法各注射PCD及生理盐水1000μl，皮片左右交换位置后移植于对侧，缝合打包固定。术后24h处死动物4只，切取皮肤及皮下组织标本做成石蜡块，术后7天、14天分别取4只动物，处死动物切取标本，做成石蜡块。
　　1.3.2皮瓣组：以腹壁下动脉为中轴，设计并形成一5cm×2.5cm的皮瓣，将含VEGF基因的脂质体100μg稀释成1000μl,10等份，每个皮瓣内选择均匀分布的5个点各注射100μl,受区皮下分5点各注射100μl,对照组同样方法各注射PCD及生理盐水1000μl，止血，缝合皮肤切口。术后第4天麻醉后，显露大鼠腹壁下动静脉并结扎，缝合切口，术后12h处死动物4只，切取标本。术后7天、14天分别取4只动物，处死动物切取标本，做成石蜡块。
　　1.3.3 游离脂肪组：取腹股沟区脂肪0.2g，均匀剪成20小块，脂肪用生理盐水洗两次，剪碎，将100μg VEGF基因加生理盐水稀释成1ml，与剪碎的脂肪均匀混合，注射于皮肤与其下的肌肉之间。对照组同样方法以PCD及生理盐水1ml与脂肪混合注射。动物于第3天，第7天和第14天处死并分离出移植物，标本用10%福尔马林固定，常规制成石蜡切片。
　　1.4血管染色及计数方法：CD34单克隆抗体作为第一抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司产品），严格按照免疫组化SP法操作步骤进行，DAB显色后苏木素复染。每张切片在×100倍光镜下定位微血管CD34强烈表达的区域，然后于高倍视野（×400）中计数微血管数量，凡是染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇集以及分叉的血管均作为一个血管计数，每张切片常规取3个视野，然后求其均值。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 PCD-VEGF165重组质粒的鉴定：用碱裂法大量提取的质粒，经过聚乙二醇纯化后，用紫外分光光度计检测所提取质粒的纯度和浓度，根据公式：样品浓度=OD260×稀释倍数×50/1000，得出DNA样品的浓度为：10.5μg/μl,OD260/OD280=1.78，比值介于1.6与1.8之间,说明获取的DNA纯度高。PCD-VEGF165经BamH I 和EcoR I双酶切后，在1.7%琼脂糖凝胶上电泳，在5.4kb和600kb处出现两条带，分别为载体和目的基因。
　　2.2常规病理学检查结果分析
　　2.2.1 皮瓣组：标本经常规染色后进行血管计数，可见血管主要集中在真皮下，其中目的基因组的血管大部位管壁菲薄，且直径明显较对照组为小（ P