内皮细胞生长因子【血管生成素协同血管内皮细胞生长因子对自体脂肪移植血运重建的影响】

　　[摘要]目的：探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)及血管生成素(ANG)协同VEGF对大鼠自体脂肪移植血运重建的影响。方法：在颗粒脂肪移植的实验动物模型中应用纤维蛋白原缓释VEGF，作用于血管生成素浸泡过的自体脂肪细胞，免疫组化法观察实验组和各对照组移植体血管生长情况，并测量各组脂肪移植体剩余体积量。 结果：实验组脂肪组织移植体血供重建良好，实验组脂肪块剩余体积明显大于对照组。 结论：VEGF能加快脂肪移植的血运重建，ANG能协同VEGF作用，从而显著提高自体脂肪移植成活率。
　　[关键词]血管内皮细胞生长因子；血管生成素；脂肪移植
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)07－0891－04
　　
　　自体脂肪组织移植已有上百年的历史，由于其来源丰富、取材容易、无排斥反应等优点，倍受整形美容外科医生的重视；但移植后的脂肪成活率较低，极大地限制了其在临床的广泛应用。如何提高自体脂肪组织移植的成活率是目前在这方面的研究热点，并已取得一定的成果。目前普遍认为VEGF是一种最重要的血管生成因子，其生物特性在临床中的应用日益受到重视。在我们的实验中，应用纤维蛋白原缓释VEGF，ANG协同VEGF作用，能明显地加快脂肪移植体的血运重建，从而显著提高脂肪移植成活率。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　实验动物和试剂：SD大鼠90只，雌性，0.20－0.25kg，由广东医学院实验动物中心提供。人VEGF165(human VEGF165，hVEGF，ONCOGEN，美国)；重组人的血管生成素(ANG－1)(购于美国R&D公司)：5％纤维蛋白原(海南医学院蛋白研究所提供)；兔抗大鼠CD31多克隆抗体、SABC法试剂盒(购于北京博奥森生物技术有限公司)。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　实验分组：90只雌性SD大鼠随机分成3组，每组30只。①空白对照组：单纯行自体脂肪移植；②实验对照组：2μg/mlANG－1 lml浸泡过的脂肪移植体内加入5％纤维蛋白原20μl及125U/ml凝血酶10μl；③实验组：2μg/mlANG－1 lml浸泡过的脂肪移植体与5％纤维蛋白原20μl、125U/ml凝血酶10μl及1μg VEGF均匀混合后移植。
　　1．2．2　实验步骤：实验动物麻醉(2％戊巴比妥2.3ml/kg)、固定、脱毛、消毒、铺巾，于左侧腹股沟上约1cm作平行腹股沟斜行切口，打开腹腔，夹出输卵管旁脂肪，切取测量1ml脂肪组织，缝合切口。背部脱毛消毒，距脊柱旁开1cm作一小皮肤切口，皮肤肉膜下作分离，形成直径1.5cm的圆形腔隙，小纱块止血，取出的脂肪块用显微剪小心剪碎成细小颗粒状，加入相应的药物。其中实验组和实验对照组放入装有2μg/ml Ang－1的烧杯中浸泡备用，再加入相应的药物，然后将各组小心填入已分离好的腔隙中，仔细缝合背部伤口。
　　1．2．3　取材与标本处理：术后7、14、28、42、64天取各组6只大鼠，取出脂肪移植体并测量其脂肪剩余体积，10％福尔马林固定。常规制作石蜡切片，每个标本切片5张，厚4μm，其中一张作HE染色，4张做免疫组化。
　　1．2．4　指标观察：①术后7、14、28、42、64天取材，标本用微刻度试管测量其剩余的体积；②HE染色后光镜下观察移植体组织细胞形态学改变；③每张免疫组化切片分别在周边区和中央区各选4个高倍(×400)视野，每个视野中进行微血管计数。参照Weidner计数方法计算出每mm2面积内微血管的量即血管密度，然后求其均值。凡是染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管均不纳入计数。
　　1．2．5　统计学分析：结果以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件处理，行t检验。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　光镜下移植体形态观察：标本行HE染色，光镜下观察移植体组织细胞形态学改变。实验组移植脂肪组织：脂肪细胞大小较均一，存在大量小体积脂肪细胞，有少量的纤维组织间隔，部分区域淋巴细胞浸润，被膜较厚且完整。空白对照组和实验对照组：大部分移植物纤维化，仅少量脂肪组织存在，大量淋巴细胞浸润，可见较大区域坏死灶，囊样脂肪池。部分动物移植的脂肪几乎完全吸收，只遗留薄层纤维组织。各组移植体内均可见新生血管形成，新生血管分布不均，边缘密集而中央较稀疏。在各期不论是移植体边缘还是移植体中央部，实验组均较空白对照组和实验对照组的血管密集。
　　
　　2．2　微血管在移植体内的生长情况：实验组移植体外周和中央部均可见多量新生血管，而外周为新生血管的“热点”，空白对照组和实验对照组新生血管数量较少且主要集中在移植体外周(图5、6)。对术后第7天、14天、28天、42天及64天脂肪移植体进行微血管的定量分析显示，实验组移植体新牛血管密度高于实验对照组和空白对照组。
　　
　　2．3　移植体存活情况：术后7天各组脂肪组织存活差别无统计学意义。术后14－64天，实验组脂肪组织存活率均高于实验对照组和空白对照组，差别有统计学意义。
　　
　　3　讨论
　　
　　血管内皮生长因子又被称为血管渗透因了(VPF)。目前发现人的VEGF有6种单体形式：VEUP121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和VEGF206，大多数细胞优先产生VEGF121、VEGF165和VEGF189，其中VEGF165是发挥生物学效应的主要成分。VEGF是内皮细胞的特异性丝裂原，可以促进内皮细胞增殖移行、增加后毛细血管和小静脉等微小血管对大分子的通透性、调节血管紧张性、促进胚胎期血管形成，对维持血管的正常状态和完整性有重要意义。ANG-1是Davis在1996年利用分子克隆技术发现的一种由498个氨基酸所组成、分子量为70000kd的糖蛋白，在血管平滑肌细胞或其他血管周围细胞表达。
　　ANG－1的主要生物学功能有：①促进内皮细胞出芽、迁移、趋化和聚集，形成原始的管状结构；②抑制内皮细胞凋亡；③维持并稳定血管作用；④抗炎作用。与其结合的Tie2受体是特异性表达于内皮细胞和某些造血祖细胞酪氨酸激酶型受体，可作用于维持成熟血管的稳定，并参与内皮细胞新生血管化过程。郭杰等实验证实了ANG－1可以提高自体脂肪移植的成活率。
　　脂肪组织游离移植以后经历了缺血和血运重建两个过程。移植体与受体建立血液循环是组织存活的关键。血运建立一方面依靠从受体向移植体长入新生血管，另一方面依靠新生血管与原有血管吻合沟通。ANG在血管的再生中可与VEGF协同发挥作用：VEGF作用于血管形成的早期，促进原始血管网的形成：ANG则作用于随后的血管改建、塑形，促进形成成熟且有空间结构的血管网。当VEGF的作用存在时，ANG可增加毛细血管管径、重建基膜、促内皮细胞增生与迁移，刺激新生血管出芽；而当VEGF的作用受抑制时ANG则加速内皮细胞死亡及血管退行性变。王彪等研究发现Ang/Tie2体系与VEGF、碱性成纤维细胞生长因子在血管瘤增生退化过程中可能起协同的作用。我们在颗粒脂肪移植的实验动物模型中应用纤维蛋白原缓释VEGF165，ANG协同VEGF发挥作用。HE染色后光镜下观察移植体组织细胞形态发现：相比于空白对照组的大部分移植体纤维化，仅少量脂肪组织残留；实验组脂肪细胞存活率大，脂肪细胞形态接近正常脂肪组织，纤维组织间隔少，淋巴细胞浸润轻，被膜较厚且完整。通过免疫组化法对微血管定性和定量分析及移植体剩余体积量测量表明：实验组移植体新生血管密度及脂肪成活率高于空白对照组(P＜0.01)，说明VEGF可以促进移植体血管化，提高移植体成活率；ANG可协同VEGF在脂肪移植早期加快移植体血供的重建，缩短脂肪移植体的缺血缺氧期，从而减轻组织坏死，提高脂肪移植的成活率。通过实验组和空白对照组的观察(P＞0.05)，纤维蛋白本身对血管生长无生物活性，只起药物载体的作用。
　　VEGF是一种生物活性多肽，通过旁分泌或自分泌发挥生理作用，VEGF需持续作用于脂肪移植体及周围受区组织才能起到良好效果。纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成纤维蛋白的过程中交联成海绵状网，而海绵体可延长药物的释放时间。VEGF的最佳有效剂量决定于移植脂肪的组织量。在参考国内外相关实验研究的基础上，我们在1m 脂肪颗粒中应用1μg VEGF，证明可以取得良好效果。本实验用5％纤维蛋白原20μl、125U/ml凝血酶10μl作为1μgVEGF的药物载体，实践证明：纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成的纤维蛋白能充分地结合VEGF，使VEGF缓慢持续地释放于移植体及其周围，起到持续作用的效果。本实验在如何更好地设计实验方案证明ANG的协同作用，VEGF的最适剂量、ANG的最适浓度、浸泡的最适时间、加入的合适时机等方面尚待进一步研究。