P-CREB抑制剂_Ｐ物质抑制剂辣椒素和ｂＦＧＦ抗体对增生性瘢痕成纤维细胞增殖协同抑制作用的实验研究

　　[摘要]目的：探讨P物质抑制剂一辣椒素及bFGF抗体单独或联合使用对体外培养的人体增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法：体外培养12例增生性瘢痕组织的成纤维细胞，分别加入不同浓度的辣椒素或／和bFGF抗体，培养24h后观察细胞形态学变化，并用MTT法检测细胞增殖抑制率。结果：所有不同浓度的辣椒素(2.5，5，20，40，60，80mg／L)均能使细胞皱缩、坏死、抑制细胞增殖，其抑制作用随剂量增大而增加。中高浓度bFGF抗体(40，80mg／L)也可促使细胞皱缩、坏死，抑制细胞增殖，其抑制作用也随剂量增大而增加。辣椒素与bFCF抗体联合应用对成纤维细胞抑制作用较单独使用效果更显著(P0.05)。结论：辣椒素及bFGF抗体可抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，其抑制作用随浓度增加而增加，两者联合使用有协调作用本研究结果可能在增生性瘢痕的治疗提供新的思路和手段。
　　[关键词]P物质抑制剂(辣椒素)；抗bFGF抗体；增生性瘢痕成纤维细胞
　　
　　创伤、烧伤以及手术伤口愈合后出现的增生性瘢痕不仅影响患者的外观，同时还会伴有伤口局部的瘙痒。发生在功能部位还可出现瘢痕挛缩，导致严重的功能障碍，是困扰外科领域的一大难题。因此，有关增生性瘢痕的防治研究一直是这个领域研究的热点。本实验通过用P物质抑制剂辣椒素及bFGF抗体单独或联合作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，探讨辣椒素及bFGF抗体对瘢痕成纤维细胞增生的抑制作用，以期为增生性瘢痕的治疗提供新的方法。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　主要试剂：辣椒素、bFGF抗体及胰蛋白酶购自美国sigma公司。辣椒素纯度＞95％，辣椒素用无水乙醇、生理盐水按1:9溶解并配成所需实验浓度。
　　
　　1．2　标本收集：取增生性瘢痕标本12例，其中男性5例，女性7例，年龄在11～34岁，均取自烧、创伤后3～6个月的增生性瘢痕标本。
　　
　　1．3　成纤维细胞培养：按组织块法行成纤维细胞培养。将手术获取的增生性瘢痕组织标本去除表皮和皮下脂肪后，修剪成0.5～1.0mm大小的组织块，用含15％胎牛血清的DMEM培养液漂洗，置于37℃、5％CO细胞培养箱培养传代。实验选用第5～6代细胞。
　　
　　1．4　辣椒素及bFGF抗体对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞影响的形态学观察：将培养好的成纤维细胞分成四组，对照组仅加入培养液DMEM，辣椒素组加入含辣椒素终浓度分别为：2.5，5，10，20，40和80mg／L的DMEM培养液；bFGF抗体组加入抗bFGF抗体浓度分别为：20，40和80mg／L的DMEM培养液；辣椒素及抗bFGF抗体组加入含不同浓度的辣椒素(2．5，5，10，20，40和80mg／L)及抗hFGF抗体(20mg/L)；空白对照组仅加入DMEbl培养液，继续培养24h．显微镜下(日本OlympusCH型)观察成纤维细胞的生长情况和细胞的形态学变化。
　　
　　1．5　MTT法检测辣椒素及bFGF抗体对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞抑制率：用胰酶将细胞消化制成细胞悬液，调整悬液中成纤维细胞的密度，以1×10／L，按2001μ1／孔的密度接种于96孔细胞培养板，在细胞培养箱内孵育48h，吸出原培养液，辣椒素组加入含辣椒素终浓度分别为：2．5，5，10，20，40和80mg／L的DMEM培养液200μ1；bFGF抗体组加入抗bFGF抗体浓度分别为：20，40和80mg／L的DMEM培养液；辣椒素及抗bFGF抗体组加入含不同浓度的辣椒素(2.5，5，10，20，40和80mg／L)及抗bFGF抗体(20mg／L)；空白对照组加入培养液，继续培养(每组设置3个重复孔)20h，加入预先配好MTT溶液20μ1继续培养4h，酶标仪检测每孔吸光度值(OD值)，并按下列公式计算药物对细胞的抑制率。
　　抑制率％＝(空白组OD值-实验组OD值)／宅白组OD值×100％
　　
　　1．6　统计方法：数值用(x±s)表示，用SPSS10.0统计软件进行统计分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异显著。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　对照组成纤维细胞的形态学观察：对照组加入培养液继续培养，成纤维细胞生长良好，增殖情况良好，大部分细胞成梭形，聚集成堆，少数刚分裂细胞尚未伸展开，成小圆形。
　　
　　2．2　P物质抑制剂辣椒素对增生性瘢痕成纤维细胞的影响：应用辣椒素培养组，部分细胞皱缩成圆形，随着辣椒素浓度增加，细胞坏死增多，浓度至80mg／L时约有一半细胞坏死。
　　
　　2．3　bFGF抗体对增生性瘢痕成纤维细胞的影响：应用bFGF抗体培养组，见部分细胞皱缩成圆形，随着bFGF抗体浓度增加，细胞坏死增多，浓度至80mg/L时约有一半细胞坏死。
　　
　　2．4　联合使用P物质抑制剂和bFGF抗体对增生性瘢痕成纤维细胞的影响：各浓度的P物质抑制剂与20mg／L的BFGF抗体联合应用，细胞发生皱缩，体积变小，形状变圆，并堆积在一起，并可见许多漂浮的坏死细胞，随着P物质抑制剂浓度增加，坏死细胞增多，浓度为80mg/L时，大部分细胞已经坏死(抑制率92.97％±6.84％)。20mg/LbFGF或2.5mg／L P物质抑制剂并没有显著抑制细胞增殖，但两者联合使用可显著抑制细胞生长(抑制率15.47％±4.44％，与20mg/LbFGF或2.5mg／LP物质抑制剂单独刺激组相比P＜0.05)。
　　
　　3　讨论
　　
　　增生性瘢痕是由于烧伤、创伤及其他原因导致皮肤真皮层损伤后局部瘢痕组织过度生长的结果。成纤维细胞是瘢痕组织中的主要细胞成分，它的过度增殖则是增生性瘢痕形成的细胞基础，探讨如何抑制增生性瘢痕中成纤维细胞增殖问题一是抑制瘢痕增生研究的重点。
　　目前研究表明，P物质在正常皮肤组织中有分布，在成纤维细胞上也有表达，它是～种神经肽类物质，在增生性瘢痕组织中的分布比正常皮肤及非增生性瘢痕组织中明显增多。而神经肽受体的表达具有可塑性，P物质在增生性瘢痕形成时，P物质的受体也在随之增多，说明在组织修复及增生性瘢痕形成过程中P物质及受体起一定的作用。P物质及其受体增加可能是导致增生性瘢痕形成的原因之一。辣椒素是P物质抑制剂，是从红辣椒中提取的一种植物碱，具有局部抗炎、镇痛、止痒效果。研究表明，辣椒素可导致培养的增生性瘢痕成纤维细胞增殖能力受到显著抑制。本试验应用辣椒素作用于体外培养的人体增生性瘢痕成纤维细胞，也发现随着辣椒素浓度的增加，其对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖与活力有明显的抑制作用。
　　碱性成纤维细胞生长因子是一种多肽类生长因子，它能促进成纤维细胞的生长、增殖，是组织损伤过程中的重要环节，但成纤维细胞的过度增生又会形成瘢痕。Ono I的研究证实人体的伤口分泌物中bFGF、TGF－β等因子的含量明显升高，这些物质在瘢痕增生时持续较高的水平，推测bFGF在增生性瘢痕形成过程中应起有一定的作用。bFGF是FGFs家族中最重要的成员，当bFGF与其酪氨酸激酶型受体结合后，主要通过激发细胞内cAMP一蛋白激酶A和／或二酰基甘油-IP3(1，4，5一三磷酸肌醇)-蛋白激酶-c途径发挥其生物学效应，进而刺激成纤维细胞增殖和移行，促进胶原等胞外基质合成，诱导细胞移行、血管新生和肉芽组织形成。实验中应用抗bFGF抗体作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，发现其对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖与活力也有明显的抑制作用，提示它作为bFGF的抗体对bFW具有拮抗作用，继而抑制成纤维细胞的增殖。
　　已有报道bFGF抗体可部分阻断P物质对成纤维细胞的促增殖作用。P物质有上调bFGF表达的作用，因此我们推测P物质抑制剂辣椒素可抑制P物质上调bFSF表达的作用；P物质抑制剂和抗bFGF抗体联合可产生协同作用。为验证上述可能的假想，本实验应用辣椒素及抗bFSF抗体作用于体外培养增生性瘢痕成纤维细胞，发现它们对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖与活力均有明显的抑制作用，其抑制作用较辣椒素或bFGF抗体单独使用更强，这表明联合应用两者治疗增生性瘢痕具有潜在的临床应用价值。