[MTT法和水溶性四氮唑(WST-1)法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后活力的比较] 微量扩散法水溶性胶涂在哪
来源:工作总结 发布时间:2019-03-29 点击:
[摘要]目的:观察中波紫外线照射后HacaT细胞活力的变化并探讨水溶性四氮唑(wsT一1)法检测的适用性。方法:将HacaT细胞分为对照组(假照射组)、300J/m2、600J/m2、900J/m2紫外线照射后24h组(每组6个样本)。600J/m2紫外线照射后4h组、8h组、12h组、24h组、48h组、72h组(每组6个样本)。血球计数板计算HacaT细胞数量。四甲基偶氮唑盐(MTT)法和水溶性四氮唑(wsT-1)法活性测定HacaT细胞活性。结果:MTT法显示300J/m2、600J/m2、900J/m2紫外线照射HacaT细胞24h后光密度(OD)值明显较OJ/m2组低;wsT-1法各组OD值明显比0J/m2组低。MTT法显示600J/m。紫外线照射HacaT细胞8h、12h、24h、48h、72h后0D值明显比0J/m2组低。wsT-1法显示600J/m2紫外线照射HacaT细胞4h后OD值较OJ/m。组低;600J/m2紫外线照射HacaT细胞8h、12h、24h、48h、72h后OD值明显比0J/m2组低。wsT-1法的OD值与细胞计数、MTT法0D值呈正相关。结论:随着紫外线剂量的加大和照射后时间延长,HacaT细胞数量减少,细胞的活力下降,wsT-1代谢活性亦降低,呈时间和剂量依赖性。HacaT细胞可对wST一1进行代谢,适用于该细胞增殖研究。
[关键词]MTT法;水溶性四氮唑(wsT-1)法;中波紫外线;HacaT细胞
[中图分类号]Q813.1+1 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)02-0162-04
传统检测细胞活力方法如MTT法,过程较复杂,而新的方法如水溶性四氮唑(WST-1)法较直接,但WST-1是否能对HaCaT细胞代谢,目前国内未见报道,为了证实WST一1法可适用于检测HaCaT细胞活力,本研究用MTT法和WST-1法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后的活力,并进行比较,结果较满意,现报道如下。
1材料和方法
1.1主要试剂:四甲基氮唑盐(MTT)一Sigma:水溶性四氮唑(WST一1)试剂盒(Boehringer Mannheim公司)。
1.2细胞株:HaCaT细胞株(武汉细胞库)。
1.3主要仪器:紫外线灯(上海长兴机械厂,功率16W,波长为280~320hm,波峰值302nm);紫外线强度检测仪(上海宝山顾村电光仪器厂);BCM-100型超净工作台(苏州市苏净集团)。
1.4细胞计数方法
1.4.1将HaCaT细胞接种于24孔培养板中,接种细胞数为2×104个/孔,待细胞长至50%~60%铺满瓶底时,以PBS液置换培养基,给予不同剂量紫外线照射,照射完成后换为培养基,继续培养24h。另6组给予600J/m。紫外线照射,照射完成后换为培养基继续培养不同时间。
1.4.2加0.2ml胰酶消化,同时加0.1ml全血清灭活后用细胞计数器计算。加D-Hanks液0.8ml和0.3%台盼蓝0.1ml后,用滴管取混合均匀的细胞悬液适量滴入血球计数板,于低倍镜下计算四角四个大中格内活细胞数(即透明未着色者),按公式(四大中格细胞数/4)×10。=细胞数/m1计算(每一中格体积为O.1inm3)。
1.5 MTT法活性测定HaCaT细胞活性
1.5.1将HaCaT细胞接种于96孔培养板,每孔5×103个细胞,倒置显微镜下观察,待细胞长至50%~60%铺满瓶底时,以PBS液置换培养基,给予不同剂量紫外线照射,照射完成后换为培养基,继续培养24h。另6组给予600J/m2紫外线照射,照射完成后换为培养基继续培养不同时间。
1.5.2去除细胞培养基,用PBS冲洗3次后,加入100ul含有lmg/mlMTT,继续培养4h,弃上清液,加二甲基亚砜溶解,振荡15min(300rpm/rain),酶标仪490nm波长检测光密度(OD)值,即MTT检测值。
1、6 WST一1法活性测定HaCaT细胞活性:细胞培养同1.5.1。每孔加入即用型WST-1溶液10ul/孔,继续置37℃ 5%C02细胞培养箱孵育90min,取出培养板置振荡器上充分振荡(300rpm)lmin后在酶标仪450/630nm双波长检测光密度(0D)值,即WST―l检测值。每次实验均设一个空白对照组,对照孔吸光值应2。紫外线照射HaCaT细胞后不同时间生长增殖和活性的变化
600J/m2紫外线照射HaCaT细胞不同时问细胞数经One―way Annova分析,F=24.598,P2。紫外线照射HaCaT细胞后不同时间WST-1法0D值经0ne-way Annova分析,F=37.707,P
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