【ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路在ＣＴＧＦ促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用】 促进细胞增生的信号通路

　　[摘要]目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路是否介导结缔组织生长因子促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化。方法：体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，实验分3组：①空白对照组；②结缔组织生长因子（10ng/ml）刺激组；③磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）预处理后结缔组织生长因子刺激组。应用免疫印迹技术检测48h后a-平滑肌肌动蛋白的表达，应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率。 结果：和空白对照组相比，结缔组织生长因子刺激组细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高；经磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002预处理后，再以结缔组织生长因子刺激，细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高水平下降，经统计学分析，差别具有显著性（P＜0.05）。 结论：结缔组织生长因子能够促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路介导该效应，磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002 可抑制此效应。
　　[关键词]结缔组织生长因子；增生性瘢痕；成纤维细胞；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；转分化；a-平滑肌肌动蛋白
　　[中图分类号]R619+.9[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-
　　
　　Effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B( PI3K/PKB) signal pathway
　　LIU Jian-yi,LI Shi-rong
　　（Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China）
　　Abstract： ObjectiveTo explore if the effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B(PI3K/PKB) signal pathway. MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro. The cells were divided into three groups: ①control group，②connective tissue growth factor（10 ng/ml）stimulated group，③PI3K inhibitor LY294002（10μmol/ L）pretreated and connective tissue growth factorstimulated group. The expression of a-smooth muscle actin was examined by western blot in human hypertrophic scar fibroblasts after 48 hours. The positive ratio of a-smooth muscle actin was examined by flow cytometry.ResultsCompared with the control group, the expression and the positive ratio of a-smooth muscle actin in the connective tissue growth factor stimulated group increased. The raise level of a-smooth muscle decreased after the pretreatment of PI3K inhibitor LY294002. The results were markedly different by statistic analysis（P 　　1.2.2 western blot法检测a-平滑肌肌动蛋白表达：采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和免疫印迹杂交法。①药物作用：以10ng/ml CTGF作用HSF 48h；②细胞总蛋白的提取：弃去药物，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS) 冲洗细胞，立即加入1×SDS 上样缓冲液（含62.5 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，2% SDS，10%甘油，50mmol/L 二硫苏糖醇，0.01%溴酚蓝），迅速刮下细胞，冰上裂解，冰上细胞超声15～20s，离心，取上清液于-70℃保存；③ SDS-PAGE和免疫印迹杂交：各取20μl 细胞裂解提取物，95℃变性5min，上样，进行电泳、转膜、洗膜后封闭，加入小鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1∶500)，4 ℃过夜，洗膜，加入二抗室温下作用1h，洗膜后加化学发光液，X线片曝光，对蛋白条带进行吸光度(A) 值测定。内参照采用GAPDH。蛋白含量以a-平滑肌肌动蛋白和内参蛋白的平均光密度(OD)×面积(mm2)的比值来表示。
　　1.2.3 流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率：制备细胞悬液，收集各组细胞(细胞培养于75cm2培养瓶中)；PBS漂洗细胞两次后，离心，得到细胞沉淀；4％多聚甲醛固定30min，离心，弃上清；用0.1％皂素(内含2%BSA)通透10min，以利于抗体进入胞内，离心，弃上清；加入鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1:100)300μl，室温孵育1h；PBS洗涤两次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育30 min；PBS洗涤两次后，重悬于300μl PBS溶液中，行FCM检测。
　　1.3. 统计学方法：实验重复3次，结果以x±s表示，应用SPSS10.0 软件进行数据统计。组间比较应用方差分析，P