软骨基质 影响关节软骨细胞外基质的生物力学因素研究进展

　　关节软骨(articular cartilage,AC)指覆盖于关节表面的一层软骨，属于透明软骨。它主要由软骨细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成，其中软骨细胞是AC的特有细胞，可分泌合成ECM。AC表面光滑，主要由其ECM特性提供功能[1]，可减少相邻两骨的摩擦并缓冲运动时产生的震动。一般而言，适当的力可刺激关节软骨的生长发育，使AC在正常生理状态下发生适应性改建，从而发挥AC的正常生理功能。若在异常的生物力学作用下，关节软骨的适应性改建则可能朝着不利于功能发挥的方向进行，比如：关节软骨退行性改变、软骨骨化、关节强直等骨关节病(osteoarthritis,OA)。因此，探索关节软骨生物力学特性是有必要的。本文就生物力学因素对关节软骨细胞外基质的影响综述如下。
　　
　　1关节软骨ECM的主要成分及其功能
　　关节软骨ECM主要成分为水、胶原、蛋白多糖及非胶原蛋白等。
　　1.1胶原(collagen)：胶原占AC干重的50%～80%，主要是II、IX、XI型胶原，尤其以II型胶原为主，占软骨胶原总量的90%～95%，是关节软骨的特异性胶原[2]。关节软骨不同位置的胶原类型是有差异的，因此各型胶原所起作用也有区别。关节软骨组织学分层由内向外分为：钙化带、深层带、中间带、表层带[3]。II型胶原主要分布于深层带和中间带，交织成三维网状，其中镶嵌蛋白多糖聚合体，结合水和带点离子，固定蛋白多糖，为软骨提供抗张强度。IX、XI型胶原主要位于II型胶原表面，可能与II型胶原的网状结构稳定性有关[4]。III型和X型胶原分别在表层和深层、钙化带出现，可能与软骨的钙化有关[5]；VI型胶原在软骨细胞附近较多，能与多种细胞外基质成分作用，具有细胞锚定和信号传递的作用[6]。
　　另外，各层胶原纤维走向也不同。钙化层的胶原纤维呈网状分布，深层胶原呈辐射状排列，间层胶原具有过渡性，从细长且紧密平行状逐渐变无序，表层带胶原则按切线方向走向[7]。胶原纤维走向变异这一特性，可能影响关节软骨的形状、稳定性、拉伸强度和抗剪切力的能力 [8]。
　　1.2蛋白多糖(proteoglycan，PG)：关节软骨中的蛋白多糖，主要以聚集体形式存在，该聚集体由透明质酸（Hyaluronan，HA）、蛋白多糖单体以及连接蛋白共同组成，其中HA为骨架链，PG单体通过连接蛋白与HA相连[9]。而PG单体由氨基多糖（透明质酸除外）与核心蛋白共价结合而成，其中的氨基多糖主要是硫酸软骨素、硫酸角质素等[2]。HA是关节软骨中最主要的氨基多糖，在生理性溶解状态下它的无规则卷曲的特殊结构，提供了软骨组织的粘弹性能[10]。蛋白聚糖属于透明质酸结合蛋白家族[9]，HA将游离的聚集蛋白聚糖固定于胶原纤维网之间，保持软骨组织完整性。另一方面，蛋白多糖中常有带负电荷的糖胺聚糖长链，这些负电荷相互间的排斥力形成渗透膨胀压，可将大量水分子限制于蛋白多糖中形成凝胶，从而使软骨具有良好的粘弹性和膨胀能力[11]。
　　1.3非胶原蛋白：除了最主要的成分外，关节软骨细胞外基质还有一些非胶原性蛋白，如软骨连接蛋白、软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）等。软骨连接蛋白可通过其亚单位上的结构域与细胞外基质其他成分相结合，起连接软骨细胞与细胞外基质的作用[12]。COMP作为细胞外基质的结构蛋白之一，属于血小板反应蛋白家族，被称为血小板反应蛋白-5[13]，有证据显示COMP在细胞外基质装配过程中起重要作用[14]，因此，有学者认为COMP在关节软骨中具有相对特异性,可以作为衡量关节软骨损伤或治疗效果的标记物之一[15]。
　　
　　2生物力学因素对关节软骨ECM主要成分的影响
　　力学刺激可调节软骨细胞增殖及细胞外基质成分的代谢平衡，这点已被广为认可。关节软骨在各种功能状态下所负荷的力学刺激主要分为压应力、张应力、剪切力。
　　2.1压应力：生理条件下，AC在机体内主要承受间歇性生理液态压力。关节功能运动可使关节的静态和动态受力[16]。体外实验中，静态压力主要可通过将体外培养的软骨细胞或软骨组织置于密闭容器中，以气体和/或液体压强的改变，作用在介质表面上，传递压力至软骨细胞的方法获得；而在培养容器外围加上蠕动泵或其他具有周期性的施力装置，可以得到稳定的压力。Smith[17]对体外培养的成人关节软骨细胞施加液体静压力，分别给予4h10Mpa大小的持续静压力和频率为1Hz的间歇静压力，结果两者都会影响II型胶原和蛋白聚糖的合成，并且间歇力对胶原和蛋白多糖的刺激作用似乎更大。之前Michael等[18]在对琼脂凝胶培养中的软骨细胞施加静态及动态压力的研究中得到了类似的结论。Davisson等[19]也证实组织工程化培养的关节软骨，在受到过大的静态压缩力时可能抑制胶原和蛋白多糖的总合成，而这时同样的动态压缩力会促进胶原和蛋白多糖合成增加。copray等[18,20]的研究结果显示0.5g持续压力可以使硫酸粘多糖和胶原蛋白减少；力值接近0.5g大小频率为0.7hz的间歇压力则可能刺激基质成分的合成。
　　动物实验的研究结果与体外实验结果相一致。Trudel等[21]将大鼠膝关节持续制动，发现膝关节软骨被软化，软骨组织减少，正说明静态负荷过度后，导致了软骨的分解代谢增多。许可等[22]研究异常压应力作用于兔膝关节软骨时，II型胶原随时间越长先增加，后减少，说明软骨退化程度逐渐加深。
　　2.2张应力：在人的各项机体活动中，相对于压应力和剪切力来说，关节软骨受到张力作用的时候很少，但它仍可能存在于人类日常生理活动中，甚至是在没有外在施加负荷时，一定程度的张力也可能存在[23]。有人研究了在符合生理功能的动态张力刺激下，关节软骨发生适应性改变 [24]。Fan等[25]对体外培养的关节软骨组织放置在一个二轴向拉伸应力装置下，施加持续或间歇的正常生理范围内张力，结果显示在适当条件下间歇静张力可以刺激组织工程化的软骨生长。另一方面持续静张力则对软骨细胞新陈代谢不起作用或者是相反作用。安丙辰[26]就不同强度张应力对关节软骨细胞II型胶原和聚集蛋白聚糖m RNA表达进行研究，分别对体外培养的人股骨头关节软骨细胞施加3%、6%、15%延伸率的张应力刺激，结果15%延伸率的张应力可明显抑制关节软骨细胞II型胶原的表达，但聚集蛋白聚糖表达改变不明显，作者认为可能和功能适应性有关。顾延等[27-28]的研究也一同说明了异常应力刺激可以影响关节软骨正常生理活动及ECM成分的合成。
　　2.3剪切力：体外剪切力的获得主要通过以下几种方法：①机械搅拌式：通过叶轮或浆形搅拌器等持续转动，使细胞离心，在持续搅动的培养液中生长；②直接灌注式：也称循环流体系统，是将培养液挤压进支架内部，使细胞感受流体剪切力；③旋转壁式：由改良的直接灌注式而来，是利用液体流动力和重力形成的低水平剪切力。目前更多地应用于关节软骨细胞体外三维立体培养的研究中，为软骨组织工程化方向的研究提供线索及依据。Smith等[29]对单层软骨细胞施加1.6N/m2剪切力，发现GAG增加2倍，但同时伴有炎性因子表达增加。朱立新[30]的研究说明体外软骨组织立体培养在低转速（初始10r/min，3天后为15r/min）离心力刺激作用下，可出现胶原及蛋白多糖的合成增多。
　　通常在各种力学刺激作用于关节软骨时，ECM成分变化的同时会出现一系列相关细胞因子的变化。Sakurai等[31]阻止大鼠的咀嚼运动后，发现髁突软骨关节盘厚度减少，胰岛素类样生长因子-I受体表达也降低，说明力学作用不止可以调节ECM代谢，还可以影响与ECM代谢密切相关的胰岛素类样生长因子-I。Tanaka等[32]发现虽然血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)在成人正常软骨中不表达，但当软骨细胞暴露在炎性环境或过度的机械力作用下，VEGF的表达会重新上调，从而导致OA的发生。而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）作为降解基质的最重要酶之一，被学者发现其亚型MMP-1、MMP-3和MMP-9在病理状态下的软骨和滑膜关节下大量出现[33]，也是很容易理解的，只是具体调节机制尚未完全清楚。还有一些前炎性细胞因子可以在颞下颌关节炎患者的滑膜液里发现，如：转化生长因子-β, 肿瘤坏死因子-α, 白介素-1β, 白介素-6等，提示这些细胞因子的出现可能是对颞下颌关节的病理降解过程的反应[34-35]。
　　
　　3力与关节软骨细胞外基质间可能的传导途径
　　力学刺激可影响关节软骨ECM成分的新陈代谢，而此代谢受软骨细胞调控，这说明力学信号与细胞外基质和/或细胞之间存在某种关联。目前，普遍认可在力学信号传导过程里起重要作用的是细胞膜表面受体分子，尤以整合素（integrin）研究最多，另外一些可能的传导途径有：由Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor p rotein，RKIP）调控的分裂原活化蛋白激酶通路（Mitogen activated protein kinase，MAPK），细胞骨架（cytoskeleton，CSK）改建途径等。
　　整合素可以通过细胞骨架连接细胞、细胞外基质和各复杂的细胞内信号传递分子，是力学信号的介导，调节多种细胞的生存、繁殖、分化以及基质代谢[36]。整合素包括α和β两个亚单位，软骨细胞内表达的与软骨基质配体相应的几种整合素受体主要有 α1β1, α2β1,和 α10β1（主要是II型胶原）；α5β1, αvβ3, αvβ5和 α6β1 （主要针对连接蛋白）[36-37]。Holmvall等[38]在软骨细胞及软骨肉瘤细胞中分离到α1β1和α2β1整合素，且发现两种整合素表现出对Ⅱ型胶原的高亲和性，力刺激作用下，II型胶原和蛋白多糖成分mRNA明显增加，整合素无明显改变，说明α2β1整合素很可能介导了力学刺激。Spiteri等[39]发现在可促进组织工程化体外培养的小牛关节软骨ECM合成的周期性压力下，如果阻止了α5β1整合素的表达，则有可能抑制细胞扩散以及基质累积，这样的结果说明体外周期性压力刺激在细胞内的传导和反馈能调节基质的合成，同时也说明整合素在此过程中起重要作用。
　　RKIP属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，最初于1999年由Yeung等[40]报道，它是一种和Raf-1激酶区域相互作用的蛋白，是MAPK通路的内源性信号调控者，同时也与G蛋白偶联受体信号转导通路、NF-κB信号通路相关[41-42]。狭义的细胞骨架是指真核细胞的蛋白纤维网架体系，既具有产生主动变形的能力，又具有抵抗被动变形和受力的能力。细胞骨架蛋白中与力学刺激相关的蛋白主要是肌动蛋白、波形蛋白等[43]。目前，主导观点认为MAPK信号通路与细胞骨架之间存在“交叉对话/双向调节”作用，即MAPK级联通路的活化涉及细胞骨架，而细胞骨架结构重排又是通过MAPK介导的细胞骨架相关蛋白磷酸化来完成[44]。有研究指出MAPK通路对力学刺激下的关节软骨细胞的增殖分化也有影响，同时细胞骨架相关蛋白也发生改变，说明MAPK通路和细胞骨架蛋白与力学传导相关，只是相应压力刺激下的各项指标之间的联系及其机制，仍然不明[45]。
　　
　　4展望
　　力是一把双刃剑，不管是张力、压力、剪切力，还是持续力、间歇力，力学刺激对于关节软骨ECM的影响均是双向的。普遍认为，接近正常生理状态的力学刺激可促进ECM的合成，而过度的力学刺激则会导致ECM的分解增多或合成减少[17，19]。综上所述，AC的功能与其生物力学特性息息相关，软骨的生物力学特性利于分散压力和吸收负荷，相应生物力学刺激不仅影响软骨ECM的合成，还对软骨下骨的短期或长期损伤及改建也起关键性作用。因此，有必要对软骨细胞以及细胞外基质的力学传导调控机制进行细致生物力学特性分析，这对关节仿真模型的开发与关节软骨组织工程重建研究极为重要。生物力学因素在不同情况下对关节软骨细胞外基质的影响其内在的调节途径及机制尚待进一步研究。
　　
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　　[收稿日期]2011-02-20 [修回日期]2011-04-13
　　编辑/李阳利