不同电荷生物聚合物对聚赖氨酸抑菌活性研究

摘 要 ε-聚赖氨酸是一种天然食品防腐剂，但与人工合成化学防腐剂相比，其抑菌效果相对差，提高其的抑菌活性具有重要意义。本文利用紫外分光光度扫描分析ε-聚赖氨酸与呈不同电荷生物聚合物的相互作用，利用打孔法分析，微量稀释法以及CTC法分析不同电荷生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响。紫外可见分光光谱显示ε-聚赖氨酸与负电荷聚合物有相互作用；
带正电的乳酸链球菌素、硫酸鱼精蛋白可提高ε-聚赖氨酸的抑菌活性；
呈负电的果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素钠（CMC NA）对其抑菌活性有一定抑制作用，未带电荷的葡聚糖的影响较小。。本研究可为ε-聚赖氨酸在食品防腐中的提供一定的参考。

关键词：ε-聚赖氨酸；
生物聚合物；
抑菌活性；
大肠杆菌；
枯草杆菌 Abstract ε- polylysine is a natural food preservative, but its bacteriostatic effect is relatively poor compared with that of synthetic chemical preservatives. In this paper, the interaction between ε-polylysine and the biopolymer with different charge was analyzed by ultraviolet spectrophotometry, and the effects of different charge biopolymers on the bacteriostatic activity of ε-polylysine were analyzed by drilling method, microdilution method and CTC method. Uv-vis spectra show that ε-polylysine interacts with negatively charged polymers. The bacteriostatic activity of ε-polylysine was enhanced by positive streptococcus lactis and protamine sulfate. The e negatively charged pectin, carrageenan and sodium carboxymethyl cellulose (CMC NA) have a certain inhibitory effect on its antibacterial activity, while the uncharged glucan has less effect. This study can provide a reference for ε-polylysine in food preservation. Key words：ε-PL；
biopolymers；
Antibacterial activity of；
E. coli；
Bacillus subtilis 目 录 1 引 言 5 1.1 食品防腐剂 5 1.2 天然防腐剂的研究现状 5 1.3 ε-聚赖氨酸研究综述 6 1.3.1 来源及性质 6 1.3.2 抑菌机制 6 1.3.3 ε-聚赖氨酸的前景 7 1.4 目的意义及研究内容 7 2 材料与方法 8 2.1 材料试剂、仪器 8 2.1.1材料试剂 8 2.1.2 仪器 8 2.1.3 供试菌种 8 2.1.4 培养液培养基 8 2.1.5 抑菌剂的配制 8 2.2 方法 9 2.2.1 菌种活化 9 2.2.2 培养 9 2.2.3 单因素实验 9 2.2.4 不同电荷生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 9 2.2.5 ε-聚赖氨酸与不同电荷的生物聚合物相互作用研究 9 2.2.6ε-聚赖氨酸与不同电荷的生物聚合物的最小抑菌浓度测定 10 2.2.7 CTC活性染色 10 3 结果与分析 11 3.1 不同电荷的生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 11 3.1.1阳离子对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 11 3.1.2 不同阴离子聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 12 3.1.3 中性生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 13 3.2 最小抑菌浓度的测定 17 3.3 CTC活性染色 19 4 讨论与结论 21 参 考 文 献 22 致 谢 24 不同电荷生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 1 引 言 1.1 食品防腐剂 食品的腐败变质一直是全社会关注的一个重要问题，在现社会为了应对食品腐败变质问题，广泛使用食品添防腐剂来应对食品腐败变质问题，食品防腐剂能有效的抑制食品腐败，延长食品的储藏期。食品防腐剂的使用量极少，效果显著，对食品本身的风味和色泽，营养无明显的影响，甚至对食品的影响可以忽略不计，其中现社会应用最为广泛的为人工合成食品防腐剂，在国标中规定的安全添加量中使用并不会对人体造成影响，但不合法的过量使用人工合成食品防腐剂，毒素会在人体中堆积，对人体造成无法避免的伤害。天然防腐剂对人体没有这一顾虑，但因抑菌效果的不理想，防腐效果不突出等原因无法广泛使用，天然食品添加剂的这一系列缺点已然成为食品科学研究工作者的工作重点内容。

1.2 天然防腐剂的研究现状 天然的防腐剂可分为三类：植物源、动物源和微生物源[22]。

微生物源天然防腐剂是现社会最理想的天然食品防腐剂，具有无毒、安全、高效、无其他副作用的优点，符合未来食品防腐剂的发展和使用的要求，在食品行业的使用越来越广泛，主要有ε-聚赖氨酸、曲酸、乳酸链球菌等。ε-聚赖氨酸是赖氨酸残基通过羧基和氨基形成的酰胺键连接而成的短肽,与带负电荷的阴离子有较强的静电作用，有25-30个赖氨酸残基；
具有抑菌谱广,水溶性好,安全性高,热稳定性好,抑菌 pH 范围广等优点。

1.3 ε-聚赖氨酸研究综述 1.3.1 来源及性质 1977年日本学者Shima[3]等从微生物中筛选Dargendorff Positive物质时，观察到一株能稳定大量产生DP物质的放线菌白色链霉菌Streptomyces albulus，现其培养液过滤后有一种对德拉根道夫实验呈阳性的化合物，该物质经证实为一种由单一赖氨酸在α-羟基和ε-氨基形成酰胺键而连接成的聚氨基酸[4]，有20～30个赖氨酸单体，为ε-聚赖氨酸 (ε-poly-L-lysine，ε-PL)。

ε-聚赖氨酸是可以一种溶于水微溶于乙醇的多肽物质，是一种重要的生物碱，其可被生物降解。物理性质为青黄色，通常呈粉末状，具有较强的除湿特性，空间结构呈直链状，由多个赖氨酸组成，具有很高的热稳定性，杀菌能力较强，水溶性和热稳定性好，pH值对它不能产生影响，熔点不固定，一般在温度高于250℃时软化分解。ε-聚赖氨酸的抑菌活性受到分子量影响，抑菌活性最佳的分子量为3600-4300，分子量低于1300时失去抑菌活性。红外光谱分析反映出ε-聚赖氨酸的强吸收峰值大约在1680～1640cm -1和1580-1520cm-1[6]。

1.3.2 抑菌机制 ε-聚赖氨酸抑菌效率很高，在低浓度时就有抑菌活性；
ε-聚赖氨酸的抑菌机制主要表现在以下几个方面:（1）作用于细胞壁和细胞膜系统，并在细胞膜上形成孔道，导致小分子物质渗出，细胞外液渗透压升高，细胞物质合成受阻，当细胞膜破裂时，大分子的物质溢出，最终导致细胞死亡，从而起到抑菌防腐作用[7]。（2）作用于遗传物质，改变遗传性状。（3）作用于酶或者功能蛋白，影响蛋白质的合成和正常生理代谢功能。其化学组成是由人体必需氨基酸L-赖氨酸构成的多肽，经消化后又可变成单一的赖氨酸而成为人体营养的强化剂，故聚赖氨酸作为食品防腐剂，具有无毒副作用，安全性高的特点。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用具有增效作用，但遇酸性多糖、磷酸盐、盐酸盐、等可能因结合而使活性降低，同时ε-聚赖氨酸也具有一定的抗噬菌体的能力[9]。

刘慧[10]等研究表明ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌以及酵母菌有明显抑制效果；
ε-聚赖氨酸单独使用时对革兰氏阴性菌的效果不明显，但与醋酸复合使用后对枯草芽胞杆菌有明显抑制作用；
高温处理后的ε-聚赖氨酸对微球菌仍有抑菌活性[7]，显示ε-聚赖氨酸具有良好的热稳定性能；
ε-聚赖氨酸在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性能，而在酸性和碱性条件下抑菌效果不明显[11]。

1.3.3 ε-聚赖氨酸的前景 随人民生活水平不断提高，对食品要求更高了：更多样化、更新鲜、更有营养、更健康，尤其对食品的添加剂和防腐剂也要求越来越高[23]。我国的食品防腐剂多年来一直以化学防腐剂为主，天然食品防腐剂只有少数的几种。ε-聚赖氨酸不同于传统化学合成的防腐剂，是一种天然防腐剂。添加ε-聚赖氨酸于加工食品中就能够达到防腐抑菌的目的，且在ε-聚赖氨酸不会影响食品本身的风味，有同时具有安全性，使得ε-聚赖氨酸被广泛应用于食品加工防腐[16][17][19][20][21]，且ε-聚赖氨酸2003年10月美国食品药物管理局批准其为安全食品保藏剂[15]，在日本食品加工行业，ε-聚赖氨酸已作为一种食品防腐剂进行使用并生产。而我国于2014年批准ε-聚赖氨酸作为一种食品防腐剂添加至食品保鲜。

1.4 目的意义及研究内容 本项目以革兰氏阴性菌大肠杆菌、阳性菌枯草芽孢杆菌为指示菌，采用琼脂扩散法，研究不同电荷聚合物、对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响。紫外-可见光扫描光谱分析ε-聚赖氨酸与带不同电生物聚合物，96孔板测定ε-聚赖氨酸的最小抑菌浓度及其混合物的最小抑菌浓度，CTC活性染色测定抑菌效果，可为ε-聚赖氨酸在食品中的科学应用提供一定的科学依据。

2 材料与方法 2.1 材料试剂、仪器 2.1.1材料试剂 ε-聚赖氨酸、果胶、卡拉胶、葡聚糖、溶菌酶、硫酸鱼精蛋白。

2.1.2 仪器 仪器 型号 生产厂家 恒温培养箱 超净工作台 全自动高压灭菌锅 电热鼓风干燥箱 恒温培养摇床 电子天平 DHP-9272A SW-CJ-2D YXQ-SG46-280S DHG-9070A NRY-2010C YP802N 上海飞越实验仪器有限公司 苏州净化设备有限公司 上海博讯实业有限公司 上海飞越实验仪器有限公司 上海南荣实验设备有限公司 上海精密科学仪器有限公司 2.1.3 供试菌种 革兰氏阳性菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 革兰氏阴性菌种 大肠杆菌（Escherichia coli) 2.1.4 培养液培养基 培养基 操作步骤 营养琼脂 牛肉膏 1g、酵母膏 2g、蛋白胨 5g、NaCL 5g、琼脂15g、加水定容至1000ml调pH为7.4 121℃高压灭菌15min备用 营养肉汤 蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCL 5g、加水定容至1000ml，分装30ml 121℃高压灭菌15min备用 2.1.5 抑菌剂的配制 2% ε-聚赖氨酸：称取0.1克的ε-聚赖氨酸至5mL的无菌水中使其溶解。

1%果胶：称取0.1克的果胶至10ml的无菌水中加热使其溶解。

1%葡聚糖:称取0.1克的葡聚糖至10ml的无菌水中使其溶解。

4%鱼精蛋白：称取0.4克的鱼精蛋白至10ml的无菌水中使其溶解。

2%溶菌酶：称取0.2克的溶菌酶至10ml的无菌水中使其溶解。

0.2%卡拉胶:称取0.2克卡拉胶至100ml的无菌水中、加热使其溶解。

2.2 方法 2.2.1 菌种活化 超净工作台中接种环划线接种。37℃培养24h活化。将活化的菌种接种至营养肉汤中，200rpm摇床培养16h。

2.2.2 培养 将活化的菌种接种至装有30mL营养肉汤150mL的三角瓶，37℃培养箱中培养24小时。

2.2.3 单因素实验 超净工作台中取菌液（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）加入培养皿制，加入约20ml营养琼脂，加入1ml菌液，菌液浓度约为1×103，用7mm打孔器打孔，注入ε-聚赖氨酸以及其他不同测试物：ε-聚赖氨酸的浓度为0.05%,其他成分的浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，设置空白对照组。37℃恒温箱培养24h。测量抑菌圈大小。

2.2.4 不同电荷生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 枯草芽孢杆菌的平板中加入果胶、卡拉胶、葡聚糖、鱼精蛋白、溶菌酶以及ε-聚赖氨酸和复合物为对照。比例以及浓度按2.2.3进行。在指示菌为大肠杆菌按以上方法。

2.2.5 ε-聚赖氨酸与不同电荷的生物聚合物相互作用研究 利用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，蒸馏水作为对照分别记录200nm-500nm吸光度值。扫描0.2mg/ml ε-聚赖氨酸分别与0.2 mg/ml不同物质混合测试物。

2.2.6 ε-聚赖氨酸与不同电荷的生物聚合物的最小抑菌浓度测定 利用96孔板对ε-聚赖氨酸与不同电荷的生物聚合物按比例混合，聚赖氨酸最为对照组，37℃恒温箱培养24h，观察其最小抑菌浓度。

2.2.7 CTC活性染色 利用CTC染色观察果胶、葡聚糖、鱼精蛋白、溶菌酶、卡拉胶按浓度0.001%、0.002%、0.004%、0.008%、0.01%与0.002%ε-聚赖氨酸抑菌混合反应，大肠杆菌、枯草杆菌菌液为对照组，ε-聚赖氨酸比例为1，按1:0.05、1:0.1、1:0.5、1:1混合，并做好标记。

溶液按比例混合，观察抑菌活性，利用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，二甲基亚砜作为对照记录470nm吸光度值。

3 结果与分析 3.1 不同电荷的生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 3.1.1阳离子对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 考察实验结果可以看出，添加溶菌酶可提高ε-聚赖氨酸抑菌活性。

溶菌酶使ε-聚赖氨酸对大肠杆菌抑菌性变高，随浓度逐渐增大，溶菌酶与ε-聚赖氨酸产生了正向促进作用，带阳离子的溶菌酶与同样带阳离子ε-聚赖氨酸产生反应所以抑菌效果的提高明显：溶菌酶的含量逐渐增加时，抑菌圈增加明显，ε-聚赖氨酸单独使用的抑制效果不大，与溶菌酶混合时增幅效果较好，随着溶菌酶的比例增加，抑菌效果增加明显。

表1不同溶菌酶/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 溶菌酶 2mm 2mm 3mm 4mm 6mm 混合 2mm 3mm 4mm 4.5mm 7mm 表2不同溶菌酶/ε-聚赖氨酸比例对抑制枯草杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 溶菌酶 2mm 2mm 3mm 4mm 6mm 混合 2mm 3mm 4mm 4.5mm 5mm 考察实验结果可以看出，硫酸鱼精蛋白对ε-聚赖氨酸抑菌活性有促进增强作用。硫酸鱼精蛋白带阳离子电可能可使细胞质膜形成孔洞，破坏细菌生长，与ε-聚赖氨酸形成协同促进作用，使抑菌活性增大，增加了ε-聚赖氨酸的抑菌活性[13]。

表3 不同硫酸鱼精蛋白/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 硫酸鱼精蛋白 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 1mm 1.5mm 1.5mm 1.5mm 2mm 表4 不同硫酸鱼精蛋白/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 硫酸鱼精蛋白 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 1mm 1mm 1.5mm 1.8mm 2mm 3.1.2 不同阴离子聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 考察实验结果可以看出，不同比例果胶对ε-聚赖氨酸活性有抑制作用，而随浓度提高，对ε-聚赖氨酸的抑菌效果越发明显。两者混合后产生了沉淀，形成了复合物，使其在光谱上发生了变化。

ε-聚赖氨酸对革兰氏阴性菌具有明显抑菌效果。果胶在酸性条件下有一定的抑菌性。ε-聚赖氨酸与带负电荷的物质具有强静电作用力，并且对生物膜有良好穿透力，导致细胞死亡，起到抑菌防腐作用。随果胶浓度提高，ε-聚赖氨酸抑菌活性有一定提高。但随果胶含量进一步提高，ε-聚赖氨酸抑菌活性逐渐下降。

表5 不同果胶/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 果胶 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 1mm 1.5mm 0mm 0mm 0mm 表6 不同果胶/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 果胶 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 1mm 0mm 0mm 0mm 0mm 考察实验结果可以看出，带阴性电的卡拉胶与ε-聚赖氨酸比例混合，卡拉胶对ε-聚赖氨酸的抑菌活性有这一定的影响。卡拉胶对ε-聚赖氨酸抑菌活性有抑制作用，卡拉胶与ε-聚赖氨酸混合现成沉淀，可能是卡拉胶粘性大，使得ε-聚赖氨酸扩散困难，其含量越多，对ε-聚赖氨酸的负面影响越大。

表7不同卡拉胶/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 卡拉胶 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 表8不同卡拉胶/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 卡拉胶 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 3.1.3 中性生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响 考察实验结果可以看出，葡聚糖对ε-聚赖氨酸抑菌活性有一定影响，在大肠杆菌中影响并不明显。而在枯草杆菌中有着一定的影响，但影响并不明。

表8不同葡聚糖/ε-聚赖氨酸比例对抑制大肠杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 葡聚糖 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 1mm 1mm 1mm 1.5mm 1.6mm 表9不同葡聚糖/ε-聚赖氨酸比例对抑制枯草杆菌活性的影响 溶液 浓度 0.5% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% ε-聚赖氨酸 1mm - - - - 葡聚糖 0mm 0mm 0mm 0mm 0mm 混合 1mm 1mm 1mm 0mm 0mm 3.1.4 阳性生物聚合物与ε-聚赖氨酸混合两者混合物的紫外-分光扫描光谱 在3-1-1实验中得出，添加溶菌酶可提高ε-聚赖氨酸抑菌活性。图3-1基于紫外-可见扫描光谱可以看出，两者间有一定相互作用。

图3-1 溶菌酶、ε-聚赖氨酸以及两者混合物的在200-350nm下的紫外-分光扫描光谱 在实验3-1-1中得出，硫酸鱼精蛋白对ε-聚赖氨酸抑菌活性有促进增强作用。图3-2可知两者的混合物的无太大变化，两者未产生新聚合物。

图3-2 鱼精蛋白、ε-聚赖氨酸以及两者混合物的在200-350nm下的紫外-分光扫描光谱 3.1.5 阴性生物聚合物与ε-聚赖氨酸混合两者混合物的紫外-分光扫描光谱 在3-1-2实验中得出果胶对ε-聚赖氨酸活性有抑制作用，两者混合后可产生了沉淀，形成了复合物，使其在光谱上发生了明显变化。

图3-3果胶、ε-聚赖氨酸以及两者混合物的在200-350nm下的紫外-分光扫描光谱 卡拉胶与ε-聚赖氨酸混合后反应现成沉淀，产生复合物，使其在光谱有明显的变化。卡拉胶与ε-聚赖氨酸混合现成沉淀，使得ε-聚赖氨酸扩散困难，得知其含量越多，对ε-聚赖氨酸的负面影响越大。

图3-4卡拉胶、ε-聚赖氨酸以及两者混合物的在200-350nm下的紫外-分光扫描光谱 3.1.6 中性生物聚合物与ε-聚赖氨酸混合两者混合物的紫外-分光扫描光谱 实验3-1-3中得知葡聚糖对ε-聚赖氨酸抑菌活性有一定影响，将两者混合，两者混合物的紫外-可见分光扫描光谱图3-5可知，葡聚糖与ε-聚赖氨酸的混合物光谱上与理论值有无较大差别。

图3-5葡聚糖、ε-聚赖氨酸以及两者混合物的在200-350nm下的紫外-分光扫描光谱 3.2 最小抑菌浓度的测定 含不同浓度抑菌剂培养基制备: 将肉汤培养基加入96孔板孔中。含不同浓度抑菌剂培养基制备: 将稀释至0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%，观察ε-聚赖氨酸的最小抑菌浓度，得到最小抑菌浓度为0.03%。ε-聚赖氨酸与带不同电荷的聚合物按1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5混合，使用菌浓约为1×103，37℃恒温培养24h。

表1 ε-聚赖氨酸对枯草杆菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度 浓度 0.001% 0.002% 0.003% 0.004% 0.005% 枯草杆菌 ++ + - - - 大肠杆菌 + + - - - 注: 表中“-”表示无微生物生长,“+”表示有少量微生物生长,“++”“+++”分别表示微生物生长的量。

将已知最小抑菌浓度的ε-聚赖氨酸（0.003%）与1%果胶、1%葡聚糖、4%鱼精蛋白、2%溶菌酶、0.2%卡拉胶按1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5混合，浓度使用菌浓约为1×103，37℃恒温培养24h。

表2 ε-聚赖氨酸与不同电荷聚合物比例混合对大肠杆菌最小抑菌浓度 比例 ε-pl+葡聚糖 ε-pl+果胶 ε-pl+卡拉胶 ε-pl+溶菌酶 ε-pl+硫酸鱼精蛋白 1:0.02 - + + - + 1:0.03 - - - - - 1:0.04 - + - - - 1:0.05 - + - - - 1:0.2 - ++ + - - 1:0.3 - ++ ++ - - 1:0.4 + +++ +++ - - 1:0.5 + +++ +++ - - 表3 ε-聚赖氨酸与不同电荷聚合物比例混合对枯草杆菌最小抑菌浓度 比例 ε-pl+葡聚糖 ε-pl+果胶 ε-pl+卡拉胶 ε-pl+溶菌酶 ε-pl+硫酸鱼精蛋白 1:0.02 - + + - - 1:0.03 - - - - - 1:0.04 - - - - - 1:0.05 - - - - - 1:0.2 - ++ + - - 1:0.3 - ++ + - - 1:0.4 + +++ + - - 1:0.5 ++ +++ ++ - - 观察96孔板内微生物的生长情况，ε-聚赖氨酸（0.003%）与葡聚糖（1%）按1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.2、1:0.3混合时抑菌效果明显，葡聚糖的浓度增加，对ε-聚赖氨酸（0.003%）的影响变大，ε-聚赖氨酸（0.003%）的抑菌效果变小。ε-聚赖氨酸（0.003%）与果胶（1%）混合时，ε-聚赖氨酸对大肠杆菌的抑菌效果变差，随着混合比例增加ε-聚赖氨酸对枯草杆菌的抑菌效果效果明显变差。ε-聚赖氨酸（0.003%）与卡拉胶（0.2%）按1:0.03、1:0.04、1:0.05比例混合，ε-聚赖氨酸抑菌效果明显，随着卡拉胶的比例增加，抑菌效果明显变差，ε-聚赖氨酸（0.003%）与溶菌酶（2%）混合，抑菌效果显著，无大肠杆菌、枯草芽孢杆菌生长。ε-聚赖氨酸（0.003%）与硫酸鱼精蛋白（4%）混合，抑菌效果显著，无大肠杆菌、枯草芽孢杆菌生长。

3.3 CTC活性染色 （1）菌悬液制备:用移液管分别取大肠杆菌和枯草杆菌菌液0.3mL于离心管中，以5000r/min离心5min。弃上清液，加入无菌水至10mL，搅拌均匀，离心5min，除去上清液加无菌水至10mL，充分混匀。

（2）取1.5mL离心管，每管取0.3mL大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌液为对照组，另取离心管只加0.02%ε-聚赖氨酸，其余五管依次加入测试物0.01%果胶、0.01%葡聚糖、0.04%鱼精蛋白、0.02%溶菌酶、0.02%卡拉胶为对照组，并按0.02%ε-聚赖氨酸为1，1:0.05、1:0.1、1:0.5、1:1混合，并做好标记。

（3）37℃恒温培养作用1h加入3μL增强剂和1.2μL染色剂混匀，继续作用30min后5000r/min离心5min，弃上清液，加入二甲基亚砜5mL,混匀。待混合均匀后5000r/min离心5min，观察其颜色变化。

观察实验结果，对照组果胶、葡聚糖、卡拉胶、无抑菌效果，颜色为深红色。鱼精蛋白有微小抑菌效果为红色，ε-聚赖氨酸、溶菌酶有明显抑菌效果，为淡红色。按比例混合后，带有阴离子的果胶、卡拉胶对ε-聚赖氨酸的抑菌效果有明显抑制，颜色无变化，为红色，微生物存活率较高。带有阳离子的溶菌酶、鱼精蛋白对ε-聚赖氨酸的抑菌效果有明显增强，颜色为淡红色，随着比例的增加，颜色为无色，微生物存活率降低。带中性电的葡聚糖对ε-聚赖氨酸的影响随着比例的增加，影响明显，颜色由淡红色至橙色，随着比例的增加，微生物存活率降低。

3-6 CTC活性染色大肠杆菌/枯草芽孢杆菌活菌制剂微生物存活率 4 讨论与结论 考察了不同电荷生物聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响。利用紫外-可见光扫描光谱分析ε-聚赖氨酸与不同带电生物聚合物以及多阳离子肽相互作用，主要结论如下：
果胶、卡拉胶分别与ε-聚赖氨酸混合，形成了沉淀。溶菌酶与ε-聚赖氨酸产生聚合物，光谱上发生明显变化，其不同浓度比例使ε-聚赖氨酸抑菌活性得到提高。带不同电荷生物聚合物对ε-聚赖氨酸的抑菌活性的影响不同。阳离子聚合物，随浓度提高，ε-聚赖氨酸抑菌活性增强；
带负电的聚合物对ε-聚赖氨酸抑菌活性有不利影响，卡拉胶的影响最大，果胶的影响最小，其浓度进一步提高，ε-聚赖氨酸抑菌效果降低；
不带电的中性聚合物仅对ε-聚赖氨酸产生轻微影响。观察各个抑菌圈，以硫酸鱼精蛋白、溶菌酶的活性增效效果最强。

利用96孔板观察ε-聚赖氨酸与不同电荷的聚合物比例混合，得知ε-聚赖氨酸对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.003%，对枯草杆菌的最小抑菌浓度同为0.003%，其中按比例混合。溶菌酶与聚赖氨酸反应：对ε-聚赖氨酸的抑菌效果有明显的增强效果。葡聚糖与ε-聚赖氨酸反应：葡聚糖对ε-聚赖氨酸无明显影响。鱼精蛋白与ε-聚赖氨酸反应：ε-聚赖氨酸的抑菌效果有明显的增强效果。果胶与ε-聚赖氨酸反应：对ε-聚赖氨酸抑菌有明显的减弱，随着果胶比例的增加对ε-聚赖氨酸的影响增加。卡拉胶与ε-聚赖氨酸反应：对ε-聚赖氨酸抑菌效果有明显的减弱，随着比例和浓度的增强对ε-聚赖氨酸的抑菌效果影响增强。

利用CTC活性染色的实验结果表明，带有阴性点的果胶、卡拉胶对ε-聚赖氨酸的抑菌效果有抑制作用，带有阳性电的溶菌酶和硫酸鱼精蛋白有增强作用，带中性电的葡聚糖对ε-聚赖氨酸的影响随着浓度比例的增加，抑制效果增加。

随着社会发展人们开始对食品安全性食品添加剂的意识提高,化学防腐剂将面临挑战, 天然、无毒、无副作用的高效的食品防腐剂即将成为今后社会的发展趋势。ε-聚赖氨酸是一种天然的生物代谢产品,杀菌能力和和对热稳定性好，是一种良好的防腐性能的生物防腐剂。ε-聚赖氨酸近几年成为了每个国家食品安全添加剂的研究的重点。尤其是在日本对ε-聚赖氨酸的研究相对比较成熟，并进行了批量的产品生产，但随着学者的研究深入，ε-聚赖氨酸的潜力得到发掘，ε-聚赖氨酸有这对药用和食品防腐剂的巨大潜力可供研究开发，并可开发投入使用。

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