【重组人血管内皮抑制素对血管内皮细胞的作用】恩度

　　[摘要]目的：探讨重组人血管内皮抑制素(YH-16)对血管内皮细胞（EC）的作用。方法：传代培养ECV304，将不同浓度的YH-16作用于生长旺盛的EC，以MTT法筛选有效浓度。以有效浓度的YH-16作用于EC，在不同时相点光镜下观察EC形态，MTT检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期，实时荧光定量PCR检测VEGF的表达量。结果：YH-16作用后，光镜下可见EC发生弥散性坏死。MTT检测显示吸光度降低，流式细胞术示G2期细胞比例增多，实时荧光定量PCR检测示VEGF表达量明显降低。结论：YH-16可明显抑制EC的生长增殖，可能通过抑制EC分泌VEGF，从而抑制EC增殖、迁移及血管的形成。
　　[关键词]重组人血管内皮抑制素；血管内皮细胞；细胞培养
　　[中图分类号]R96[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-04
　　
　　Effects of recombinanted human angiostatin on vascular endothelial cell
　　WU Shang-min1,ZHAO Ya-nan1,YANG Li2,WANG Lu2,GUO Shu-zhong2,LIU Yin1,LIU Dan2,LU Kai-hua2
　　（1. Department of Plastic Surgery,Second Afiliated Hospital,Kunming Medical College, Kunming 650101, Yunnan,China.2.The Centre of Plastic Surgery,the Fourth Military Medical University, Xi"an 710032,Shaanxi,China）
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the function of recombinanted human angiostatin (YH-16) on vascular endothelial cell (EC)． Methods①Different dosage of YH-16 was used in the vascular endothelial cell, and the effective concentration (10μg/ml) of YH-16 was examined by MTT method.②The test was divided into three groups randomly as YH-16 - experiment group, PBS- blank control group and RPMI-1640 medium - positive group.③In the following 24h、48h and 72h interventions, the morphous of EC was observed by photology inverted microscope, the cytoactive was detected by method of MTT and the cell cycle was investigated by flow cytometry(FLC).The expression of VEGF was dectected by real-time fluorescent quantitate polymerase chain reaction(Real-time PCR). ResultsECs were necrosis in the effect of YH-16, and many cell debris can be seen under the light microscope. The absorptance was degraded by MTT assay(P 　　1.2.2流式细胞仪检测EC周期分布：取生长良好的EC以细胞密度约5×107/孔传代于25cm2培养瓶内，待细胞贴壁后加入无血清RPMI-1640 培养液(SIGMA公司，美国)继续培养24小时。分三组进行如下实验：实验组加入10μg/m1的YH-16；阴性对照组加入含10％小牛血清RPMI-1640 培养液；空白对照组加入PBS液。继续培养24h后用胰酶消化制成单细胞悬液（1.0×105/ml），离心沉淀，PBS漂洗，70％乙醇固定，4℃保存，送检。
　　1.2.3实时荧光定量PCR检测VEGF在EC中的表达
　　1.2.3.1 分组实验：取生长良好的ECV304常规传代以细胞密度约1.0×107/孔接种于6孔培养板中，每孔加入细胞悬液1ml，移入37℃、5％CO2孵箱培养24h。在细胞生长至铺满80%孔底后，实验组加入10μg/m1的YH-16；阴性对照组培养瓶中加入含10％小牛血清RPMI-1640 培养液；空白对照组培养瓶中加入PBS液。继续培养24h后提取RNA进行实时荧光定量PCR检测。
　　1.2.3.2 EC中总RNA的提取：按TRizol总RNA提取试剂盒（Bio-Rad，USA）说明进行操作。
　　1.2.3.3 RT反应：按照RT-PCR试剂盒（Bio-Rad，USA）中的说明书操作。将配制好的RT反应液离心数秒混匀，迅速置于PCR反应仪中；设置反应条件：65℃ 5min，42℃ 1h；90℃ 5min。所得模板cDNA产物小管分装，置于-80℃冰箱保存待用。
　　1.2.3.4 Real-time PCR：PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。VEGF（扩增片段为145bp）：Forward5"- TGT CCT CAC ACC ATT GAA ACC ACT A -3"，Reverse5"- AAT GGG CAC GTG GAT CCT G -3"。GAPDH（扩增片段为138bp）：Forward5"-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3"，Reverse5"- TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3"。在无菌的Eppendorf管中按照SYBR? ExScriptTM PCR Kit（Bio-Rad，USA）说明书表格中的体积将配制好的Real-time PCR反应液（反应总体积为20?l）离心数秒，混匀后迅速置入荧光定量PCR反应仪中，以95℃3min，95℃10s，60℃15s ×39circles，72℃20s，读板，溶解曲线分析：65℃～98℃，每0.3℃读板一次，持续1s 进行反应后，4℃保存。每次PCR反应均以增生性瘢痕组织成纤维细胞为阳性对照，DEPC水为阴性对照。
　　1.3 统计学分析： 采用SPSS13.0 医学统计软件包作统计学分析，实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验比较各组间差异，P=0.05为检测水准。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 YH-16作用后EC活性及最适浓度
　　2.1.1 YH-16作用后EC细胞生长曲线及抑制率见图1、2。结果示：YH-16组、RPMI-1640组及PBS组组间比较P=0.000，差异有统计学意义。在YH-16内，72h与48h比较，P=0.027；72h与24h比较：P=0.034，其差异有统计学意义，而48h与24h比较，P=0.151，其差异无统计学意义。YH-16的最适浓度为10μg/m1。
　　
　　2.1.2 EC的形态在YH-16作用后即出现皱缩坏死改变，约70%的细胞出现坏死，至24h后细胞出现崩解，72h遗留不完全细胞轮廓（图3），而RPMI-1640组细胞生长良好，仍呈鹅卵石样排列（图4），PBS组细胞均漂起。
　　
　　2.2 流式细胞仪检测细胞周期分布：见表1。
　　
　　
　　2.3 Real-time PCR结果
　　2.3.1 细胞总RNA提取：提取的RNA经紫外分光光度计检测其纯度，比值为A260/A280＞1.8，标本总RNA浓度为0.25～0.65ng/μl。
　　2.3.2 标准曲线的建立：以样品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，拟合标准回归曲线。每份管家基因GAPDH（该基因作为内对照）标准模板中所含的cDNA依次为256×106、64×106、16×106、4×106、1×106，并对标准曲线进行优化（图5）；每份VEGF所含的cDNA依次为256×105、64×105、16×105、4×105、1×105，并对标准曲线进行优化（图6）。图示回归系数均大于0.99，拟合满意。用下列公式计算Ct值减少1个循环对应的模板DNA增加的倍数：Y=41/ΔCt。根据公式，YGAPDH=2.07911，YVEGF=2.026666。
　　
　　2.3.3 VEGF cDNA相对拷贝数的测定：读取待测样本中VEGF cDNA和GAPDH cDNA的Ct值，然后分别将其与预先随机设定的样本标准值进行校对后（本实验标准值分别设定为：CTVEGF=25，CTGAPDH=23），根据公式目的基因含量=标准样本绝对拷贝数×2.02666625-CTVEGF测/2.0791123-CTGAPDH测(1.319856)计算目的基因含量。以此对确定样本中VEGF cDNA含量，比较YH-16作用前后VEGF cDNA含量的差异。实验结果显示，YH-16作用前后VEGF cDNA含量分别为（1.179±1.029）×106、（4.983±0.027）×105，前者明显高于后者，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　注：根据回归直线得出，标准样本VEGF cDNA绝对拷贝数为893829.7，内对照GAPDH cDNA绝对拷贝数为946058。
　　
　　3讨论
　　
　　3.1 YH-16的作用及在血管瘤中的研究：内皮抑素(endostatin,ES)为是内源性血管形成抑制因子之一，能特异性地作用于内皮细胞，尤其是微血管的内皮细胞，控制新生血管内皮细胞的增殖, 诱导其凋亡，抑制其迁移，从而抑制血管生成和肿瘤生长[3-5]，达到抗肿瘤的作用，为治疗恶性肿瘤提供了新的途径[6]。
　　YH-16是第一个用于临床研究的内源性血管生成抑制剂，临床前研究表明其直接作用于血管内皮细胞，能有效地抑制新生血管，具有较好的疗效和安全性[7,8]，可抑制人内皮细胞迁移，对S180肉瘤细胞株、H22肝癌细胞株、人胃癌SGC7901细胞系、人宫颈癌Hela细胞系及人肺腺癌等细胞株裸鼠和小鼠移植瘤均有明显的抑制作用，无明显毒副反应[9]。王轩等[10]应用逆转录病毒将人endostatin的基因导入人肝癌SMMC7721，免疫组化及Western blot证实，转endostatin的人肝癌细胞能稳定表达并分泌endostatin。血管内皮增殖试验表明，转基因的肝癌细胞分泌的人endostatin具有生物学活性，能显著抑制血管内皮细胞的增殖。与对照组相比，其抑制率达48%。Kulke等[11]曾报道了一项Ⅱ期临床研究结果。国内Ⅱ期临床试验[12,13]，已证实YH-16对多程化疗后复发的非小细胞肺癌显示出一定的抗肿瘤活性，安全性较好，患者耐受性好，临床受益率高。Ⅲ期临床研究也证实了YH-16 联合NP方案治疗晚期NSCLC疗效可靠，无明显不良反应[14]。目前尚未见YH-16应用于血管瘤研究的相关报道。
　　大量的动物实验和临床试验表明：血管内皮抑制素的抗肿瘤活性与时相有关，具有浓度依赖性[6]。在本实验中观察到较低浓度的YH-16对EC无明显抑制作用，而且最初24h之内抑制率不到50％，当到36h时，抑制率均增高，接近100％，其中以10μg/m1的YH-16抑制细胞增殖的能力最强。本结果证实了YH-16具有较强的抑制细胞增生的作用，而且存在一定的时间依赖性。示，YH-16作用后，主要作用于G1期，S期及G2期百分率下降，说明YH-16阻止EC进入DNA合成期，提示YH-16对EC有阻止其合成、分裂、增殖的作用，而且随时间延长，抑制作用增强。
　　3.2 VEGF的主要作用及在血管瘤中的研究：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种特异性与血管生长有关的生长因子，能特异作用于内皮细胞，与血管瘤的生成和发展有密切关系，已被人们广泛关注[15]。Tseng [16]等认为在已知的许多生长因子中，VEGF是最普遍、最有效、作用最强烈的直接作用于血管的内皮细胞生长因子。VEGF通过旁分泌与自分泌形式作用于内皮细胞[17]。可促进内皮细胞增殖，诱导血管形成；提高血管的通透性，促使纤维蛋白沉积于细胞外基质；改变细胞外基质，使其易于新生血管形成。近年研究表明，血管内皮细胞增生和血管形成在血管瘤中起重要作用[18]。Chang等[19]用免疫组化和原位杂交的方法分别检测了增生期和消退期血管瘤标本中的VEGF和VEGFmRNA，发现增生期VEGF和VEGFmRNA的表达都高于消退期，江成鸿等[20]用免疫组化检测增生期和消退期血管瘤及血管畸形标本中的VEGF，发现增生期VEGF的表达高于消退期及血管畸形中的表达，表明VEGF与血管瘤增生有密切关系。
　　3.3 血管内皮细胞在YH-16作用前后VEGF cDNA的表达量及意义：本研究采用实时荧光定量PCR检测EC在YH-16作用前后VEGF cDNA的表达含量, 结果显示：YH-16作用前VEGF cDNA表达量明显高于YH-16作用后的表达量，结合流式细胞术检测结果，表明YH-16阻止EC进入DNA合成期，从而抑制EC合成、分泌VEGF。血管瘤是一种血管过度增生的良性肿瘤，其中VEGF高表达。鉴于YH-16是一种特异性地作用于内皮细胞的内源性血管生成抑制剂药物，结合本实验结果，考虑如若将YH-16直接注入血管瘤腔内也许可以达到治疗或者是缩小血管瘤的目的，这也许会为血管瘤的治疗提供了一个更新的研究领域。
　　
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　　[收稿日期]2008-02-27[修回日期]2008-05-04
　　编辑/张惠娟