苏M_SD大鼠坐骨神经对腺样囊性癌细胞系ACC-M体外增殖能力的影响

　　[摘要]目的:研究SD大鼠坐骨神经对腺样囊性癌ACC-M细胞体外增殖能力的影响。方法:将人腺样囊性癌细胞系(ACC-M)分别与条件培养液和坐骨神经培养液共培养24、48、72h。应用MTT比色法研究SD大鼠坐骨神经对腺样囊性癌ACC-M细胞体外增殖能力的影响。结果:坐骨神经培养液对ACC-M作用48和72h后,ACC-M细胞的增殖明显高于其它组别,而共培养液则对ACC-M细胞的增殖没有明显影响。结论:SD大鼠坐骨神经培养液作用于腺样囊性癌细胞,能有效促进腺样囊性癌细胞的增殖,这可能是腺样囊性癌嗜神经侵袭的基础。
　　[关键词]坐骨神经;腺样囊性癌;增殖;嗜神经侵袭
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)04-0527-02
　　
　　Effect of SD rat sciatic nerve on proliferation of Adenoid Cystic Carcinoma Cell Line
　　ACC-M in vitro
　　YANG Xiang-ming,SUN Mo-yi,CAI Bo-lei,JIA Wen-rong, LI Jian-hu
　　(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological College,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of SD rat sciatic nerve on proliferation of adenoid cystic carcinoma(ACC).MethodsACC-M cell line was co-cultured with conditioned medium and sciatic nerve culture medium for 24,48 and 72 hours. MTT was used to detect the proliferation of ACC-M.ResultsThe proliferation of ACC-M cells incubated by sciatic nerve cultured medium for 72 hours was significantly higher than that of other groups. Co-cultured medium had no effects on the proliferation of ACC-M cells.ConclusionsSD rat sciatic nerve cultured medium can effectively promote the proliferation of ACC cells. This might be theoretic base of perineural invasion of ACCs.
　　Key words:sciatic nerve; adenoid cystic carcinoma(ACC); proliferation; perineural invasion
　　
　　涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)具有典型嗜神经性,易于侵袭神经并沿之生长,临床上常导致疼痛、麻木以及面瘫等神经损伤症状,这一特性严重影响临床疗效及预后,给临床治疗带来很大困难。有研究[1-6]报道,神经组织分泌的神经细胞粘附分子NCAM、神经生长因子NGF、神经营养因子NT-3等小分子蛋白质可通过促进肿瘤细胞增殖的方式来影响ACC的嗜神经侵袭特性。本实验通过MTT实验方法来检测SD大鼠坐骨神经培养液对腺样囊性癌ACC-M细胞系增殖能力的影响,以进一步了解神经组织与腺样囊性癌侵袭及嗜神经侵袭之间的关系。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料:人腺样囊性癌高转移细胞系ACC-M(上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面外科建系);SD大鼠(第四军医大学动物实验中心提供);牛血清白蛋白(即BSA,美国Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI1640培养基(美国Gibco公司);96孔板(美国Costar公司);市售青霉素、链霉素;MTT(即噻唑蓝,美国Sigma公司);二甲亚砜(即DMSO,美国Sigma公司);DG5031型酶标仪(华东电子管厂)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养:人ACC-M细胞系,RPMI1640培养液,由5%CO2,37℃,100%湿度培养箱连续培养,培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。选用对数生长期ACC-M细胞,弃去培养液,PBS液冲洗2次,加入0.25%胰酶,37℃孵箱中消化15min,加入含血清培养液,终止消化,以800r/min转速离心3min。加PBS液离心漂洗3次,以含血清RPMI1640培养液制成单细胞悬液。用细胞计数板调整细胞浓度至4×104/ml。
　　实验培养液的制备:无菌条件下,手术截取两段SD大鼠坐骨神经各约3cm,显微操作下仔细剥离神经外膜及血管,分别置于含10mlRPMI1640培养液的无菌细胞培养瓶中。其中一瓶接种对数生长期ACC-M细胞与坐骨神经共培养,以构建共培养液;另一瓶不做处理,单独培养坐骨神经,作为坐骨神经培养液。48h后分别用10ml离心管收集培养液,4℃冰箱保存,备用。
　　体外细胞增殖能力的测定:将上述细胞悬液接种于96孔培养板。以24、48、72h三个时间点接种细胞,每个时间点接种的细胞分4组,每组设3个复孔,每孔接种细胞悬液100μl,使每孔含细胞4 000个。第1组为对照组,加入含10%胎牛血清的RPMI1 640培养液100μl;第2、3组为实验组,分别加入共培养液、坐骨神经培养液各100μl。第4组为空白对照组,只加RPMI1 640培养液200μl,不加细胞。5%CO2、37℃、100%湿度孵箱中培养。
　　以24、48、72h时间点为准,实验终止前4h,每孔中加入MTT应用液(5mg/ml)20μl,5%CO2、37℃、100%湿度孵箱中培养4h。终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加二甲亚砜溶液150μl,震荡10min,以空白对照孔(无细胞)在DG5031型酶标仪上调零,测定490nm吸光度值。检测各孔的OD值减去空白对照组OD值为其实际数值。
　　1.2.2统计学分析:运用第四军医大学统计学教研室SPSS统计软件(版本12.0)进行t检验比较不同时间点各组ACC-M细胞的增殖水平。
　　1.3 结果:在一定细胞数量内,MTT结晶物形成量与细胞数量成正比,应用酶联免疫检测仪在490nm波长测定的吸光度可间接反映活细胞数量。本研究发现,在坐骨神经培养液作用48、72h后,ACC-M细胞的OD值明显高于其他组(P 　　涎腺腺样囊性癌具有典型嗜神经性,即易于侵袭神经并沿之生长,临床上常见患者面瘫、疼痛、麻木以及颅内神经转移等报道。侵袭行为是肿瘤播散的第一步,研究涎腺腺样囊性癌沿神经播散的机理,就必须研究肿瘤细胞在神经周围生存和增殖的机制。Ayala等[7]通过对前列腺癌嗜神经侵袭相关的肿瘤增殖机制的研究,提出了前列腺癌细胞通过NF-κB通路提高神经周围癌细胞增值能力的观点。Meggiato等[8]的研究发现具有外周神经侵袭特点的胰腺癌MIB-1水平显著提高,说明胰腺癌在神经周围的增殖水平高于其它部位。Iwamoto等[9]发现,恶性黑色素瘤表达的p75NTR与其配体NGF结合后,能够有效促进恶性黑色素瘤细胞增殖,从而使恶性黑色素瘤细胞表现出嗜神经侵袭的特性。
　　Fukuda等[1]研究发现,神经细胞粘附分子NCAM在人类涎腺肿瘤细胞株(HSGcell)中表达,可以使胱门蛋白酶-23、7、9失活,从而抑制肿瘤细胞的程序性细胞凋亡;并发现由转化生长因子-β1(TGF-β1)介导的NCAM表达上调可能促进NCAM发生同型粘附,从而进一步促进HSG细胞株增殖。这表明NCAM可能通过促进涎腺恶性肿瘤细胞的粘附和增殖来影响其侵袭神经的生物学行为。罗小龙等[2]报道一定浓度的神经生长因子NGF能有效促进腺样囊性癌细胞的体外增殖。郭峰等[3]采用NGF抗体干预ACC细胞增殖的研究方法,反证了NGF能以剂量依赖的方式促进ACC细胞增殖。这表明,NGF可能以促进ACC细胞增殖的方式来促进ACC的嗜神经侵袭。孙沫逸[4-5],王磊[6]等的在涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭相关研究中发现,神经营养因子3(NT-3)及其高亲和力受体TrkC在具有嗜神经侵袭表现的腺样囊性癌中存在过表达现象。推测一方面这可能由于神经纤维分泌的NT-3可能在神经周围的微环境中形成一定的浓度梯度从而促进肿瘤细胞的增殖并增强肿瘤细胞的侵袭;另一方面肿瘤细胞通过自分泌或旁分泌产生NT-3及其受体,诱导神经纤维定向生长最终造成肿瘤侵袭神经。以上笔者可以看到,涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭的特性可能是涉及肿瘤和神经两方面的多种原因造成的,而关于神经组织对ACC细胞增殖作用影响的研究未见报道。
　　因而笔者采用MTT法研究SD大鼠坐骨神经对人腺样囊性癌ACC-M细胞系增殖的作用。本研究中,笔者发现单纯坐骨神经培养液作用于ACC-M细胞后能显著提高ACC-M细胞的增殖水平;而共培养液对ACC-M细胞的增殖则没有明显影响,这可能是由于坐骨神经分泌的能够促进ACC-M细胞增殖的相关因子在共培养过程中被消耗,因而丧失了对ACC-M细胞增殖能力的影响,从而验证了单纯坐骨神经培养液的作用。这说明,SD大鼠坐骨神经可能通过自身分泌的因子来促进ACC-M细胞的增殖,这可能是腺样囊性癌嗜神经侵袭这一生物学行为的基础。笔者的研究表明神经组织对涎腺腺样囊性癌细胞的增殖具有较为明显的促进作用,但是具体是哪些因子独自或者协同,通过何种信号通路在发挥作用,还有待进一步探讨和研究。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Fukuda M,Horiuehi Y,Oku Y,et a1.Induction of apoptosis in human salivary gland tumor cells by anti-NCAM antibody[J]. Oncol Rep,2005,14(5):l143-1149.
　　[2]罗小龙,吕春堂,周中华,等.神经生长因子对腺样囊性癌细胞系增殖与凋亡的影响[J].口腔颌面外科杂志,2006,16(3):205-208.
　　[3]郭峰,吕春堂,李保平,等.神经生长因子对腺样囊性癌细胞增殖的影响[J].口腔颌面外科杂志,2006,16(4):307-309.
　　[4]孙沫逸,王磊,陆斌,等.酪氨酸激酶C与涎腺腺样囊性癌嗜颅神经侵袭的关系[J].中国神经外科疾病研究杂志,2004.3(4):334-336.
　　[5]孙沫逸,王磊,杨连甲,等.NGF在涎腺腺样囊性癌中的表达及与嗜神经侵袭和疼痛的关系[J].第四军医大学学报,2004,25(11):1012- 1014.
　　[6]王磊,孙沫逸,程晓兵,等.神经营养因子-3在涎腺腺样囊性癌中的表达及其意[J].实用口腔医学杂志,2004,20(3):284-286.
　　[7]Ayala GE,Dai H,Ittmann M,et at.Growth and survival mechanisms associated with perineural invasion in prostate cancer[J].Cancer Res,2004,64(17):6082-6090.
　　[8]Meggiato T,Calabrese F,Valente M,et a1.Spontaneous apoptosis and proliferation in human pancreatic cancer[J].Pancreas,2000,20(2):l17-l22.
　　[9]Iwamoto S,Odland PB,Piepkorn M,et a1.Evidence that the p75 neurotrophin receptor mediates perineural spread of desmoplastic melanoma[J].J Am Acad Dermatol,1996,35 (5 Pt l):725-731.
　　
　　[收稿日期]2009-12-27 [修回日期]2010-03-09
　　编辑/张惠娟