论文内蒙古2016-2018年度流行性感冒流行病学及病原学研究

内蒙古2016-2018年度流行性感冒流行病学及病原学研究 目 录 中文摘要 1 英文摘要 3 1 前言 6 1.1 流行性感冒的提出 6 1.2 研究背景和意义 6 2 试验材料与方法 7 2.1 流感样病例流行病学监测 7 2.2 流感病毒实验室检测 8 2.3 流感病毒基因测序 13 2.4 流感病毒耐药性检测 13 3 试验结果 13 3.1 流行病学监测结果 13 3.1.1 总体情况 13 3.1.2 时间分布 14 3.1.3 人群分布 14 3.1.4 地区分布 14 3.2 病原学监测 15 3.2.1 总体情况 15 3.2.2 优势株变化 15 3.2.3 性别分布 15 3.2.4 地区分布 15 3.3 抗原结果 19 3.4 流感病毒全基因同源性分析结果 19 3.4.1 新甲型H1N1基因同源性分析结果 19 3.4.2 季节性H3N2基因同源性分析结果 20 3.4.3 流感病毒基因序列及进化树分析结果 20 3.5 流感病毒耐药性分析结果 25 4 讨论 26 4.1 流行病学监测分析 26 4.2 病原学分析 27 4.3 遗传进化分析 28 4.4 抗原性分析 29 4.5 耐药性分析 30 5 结论 30 参考文献 32 综述 35 致谢 43 作者简介 44 插图和附表清单 1. 图1 2016年内蒙古自治区ILI时间分布复合图 14 2. 图2 2017年内蒙古自治区ILI时间分布复合图 14 3. 图3 2018年内蒙古自治区ILI时间分布复合图 15 4. 图1 新甲型H1N1流感病毒HA基因系统进化树图 22 5. 图2 新甲型H1N1流感病毒NA基因系统进化树图 25 6. 图3 季节性H3N2流感病毒HA基因系统进化树图 26 7. 图4 季节性H3N2流感病毒NA基因系统进化树图 26 8. 表1 内蒙古自治区2016-2018年各年度ILI%表 13 9. 表2 内蒙古自治区2016-2018年ILI年龄构成表 15 10. 表3 内蒙古自治区2016-2018年ILI年地区分布表 17 11. 表4 内蒙古自治区2016-2018年流感病毒阳性样本构成表 17 12. 表5 内蒙古自治区2016-2018年ILI样本不同性别阳性率比较表 18 13. 表6 内蒙古自治区2016-2018年ILI样本不同地区阳性率比较表 19 14. 表7 流感病毒抗原分析表 20 15. 表8 新甲型H1N1同源性分析表 20 16. 表9 季节性H3N2同源性分析表 21 摘 要 目 的 通过对内蒙古自治区19家哨点医院采集的2016-2018年度流感样病例的流行病学特征、病原学情况以及流感病毒的耐药性进行分析，得出此次研究的内蒙古自治区流行性感冒的流行病学特征及病原学特点，为预防和控制内蒙古自治区流感的流行提供一定的科学防控依据。方 法 1.收集内蒙古自治区2016-2018年度流感样病例的（ILI）资料，描述内蒙古自治区流感样病例在不同季节、不同地区、不同人群的ILI分布特征；
2.采用核酸检测方法对2018年度内蒙古自治区19家哨点医院采集的ILI病例咽拭子标本进行流感病毒鉴定分型，对检测结果阳性标本利用MDCK细胞进行病毒分离培养，采用红细胞凝血抑制实验进行流感病毒的分型鉴定；
3.通过GenBank网站下载当前国内外流感病毒各亚型流行参考毒株和世界卫生组织推荐的疫苗株DNA序列；
通过NCBI的blast程序进行流感病毒基因序列比对，分析流感病毒的亲缘性关系；
使用DNAStar软件进行流感病毒基因序列的重新剪切和连接，采用Mega7.0软件对测序的流感病毒毒株和推介疫苗株、国内代表株进行系统树构建，分析内蒙古自治区2018年度流感病毒基因的遗传进化特征和对神经氨酸酶抑制剂药物的耐药性。

结 果 1.流行病学监测结果：（1）从2016年到2018年，内蒙古自治区的19家哨点医院总共报告了235804例流感样病例（ILI），同一时期的哨点医院的门诊和急诊总数为1090297例，流感样病例在总的门诊和急诊就诊中所占的百分比（ILI％）为2.33％。全区15个流感监测网络实验室中共检测了35981个ILI样本，其中4728个为阳性样本，阳性率为13.14％。（2）从流行性感冒的时间分布趋势来看，2016-2018年内蒙古自治区流行性感冒各年度ILI%随时间的分布情况不一样而不尽相同，2016年度ILI%在春季的第5-13周比较集中出现了第一个流行高峰，之后全年平稳；
2017年度流行高峰则出现在年末的第49-52周；
2018年度出现两个流行高峰，分别是春季的第1周和冬季的第52周。（3）ILI人群分布则主要集中在婴幼儿和学龄前期儿童，ILI%分布靠前的两个年龄组分别是0岁组和5岁组儿童，而最低的年龄组是15岁组。（4）ILI的地区分布也因为地理位置、气候条件、人文习俗等因素的影响而不同，中西部地区的流感样病例高于东部地区。

2.病原学监测结果：内蒙古自治区2016年至2018年共采集35981例ILI流感样病例的咽拭子样本，其中4728例阳性样本为4728例，阳性率为13.14％；
不同年份阳性率差异有统计学意义（χ2=60.717，P﹤0.05），不同性别核酸检测阳性率差异无统计学意义（ χ2=2.293，P>0.05）。流感病毒核酸检测阳性率高的区域的分布与ILI区域的分布基本一致，中西部地区高于东部地区。各年度流感病毒各亚型主要流行毒株的分布也不同。2016年度主要流行毒株是乙型流感病毒；
2017年主要流行毒株为季节性H3N2流感病毒和新甲型H1N1流感病毒。其中，季节性H3N2流感病毒流行强度较新甲型H1N1流感病毒的流行强度有所加强，而2018年的主要流行毒株为乙型和新甲型H1N1流感病毒。

3.遗传进化分析结果：本研究共测序的2018年度的10株新甲型H1N1流感病毒的HA基因，结果显示测序毒株基因序列和本地区的2009年分离株、疫苗株A/Michigan/45/2015、国家代表株A/Sichuan/1/2009属于不同分支，但亲缘性较高；
NA基因则属于同一分支；
5株季节性H3N2流感病毒分离株与疫苗株属于同一分支，但与2009年内蒙古季节性H3N2分离株属于不同分支。4.耐药性分析结果：对内蒙古2018年39株新甲型H1N1流感病毒和6株季节性H3N2流感病毒的耐药性进行检测，结果表明，在39株新甲型H1N1流感病毒毒株中，只有一株是HRI（对检测药物的敏感性大大降低），其余38株均为NI（对检测药物敏感）。6株季节性H3N2流感病毒均为NI（对检测药物敏感）。

结 论 1.内蒙古自治区2016-2018年度流感样病例发病具有明显的时间规律，一般在冬春季节容易高发和流行；
地区分布来说，中、西部地区流感流行强度明显高于东部地区；
人群分布情况来看，流感样病例的高发年龄组为0～岁组和5～岁组，提示我们要加强婴幼儿及学龄前儿童流感预防和控制工作。2.在2016-2018年度间，各种流感病毒亚型混杂在一起，除了季节性H1N1流感病毒未检出外，其他病毒亚型交替成为流行株。3.在此次研究中，新甲型H1N1流感病毒分离株的HA和NA基因与我区的2009年分离株位于系统发育树的不同分支中，它们与世卫组织新推荐的流感疫苗株也位于系统发育树的不同分支上，这表明我区2018年度新甲型H1N1流感病毒可能较之前发生了一定的变异，要加强流感监测，预防发生流感的流行；
而季节性H3N2流感病毒的HA和NA基因则未发生较大变异。4.内蒙古自治区2018年度流感病毒对于神经氨酸酶抑制剂药物呈现出高度的敏感性，仅有一株呈现对检测药物敏感性降低，且未发生基因变异，仍需加强耐药检测。

关键词：流感（流行性感冒）；
流行病学；
病原学；
基因；
耐药性 Epidemiological and etiological studies of influenza in Inner Mongolia from 2016 to 2018 Abstract Objective Based on the analysis of the epidemiological characteristics, etiology and resistance of influenza virus in Inner Mongolia Autonomous Region in 2016-2018, it provides a scientific basis for prevention and control of influenza epidemic in Inner Mongolia Autonomous Region. Method 1. Collect the 2016-2018 influenza-like illness (ILI) data of Inner Mongolia through the “China Influenza Surveillance Information System“ and describe the distribution characteristics of ILI at different times, different populations, and different regions in Inner Mongolia; 2. Influenza virus nucleic acid detection method was used to identify and type influenza virus throat swab specimens collected from 19 sentinel hospitals in Inner Mongolia Autonomous Region, and MDCK cells were used for virus isolation for positive specimens; 3. Download the sequences of influenza virus subtype reference strains and recommended vaccine strains through the GenBank website, use DNAStar and Mega7.0 software to perform influenza virus sequence splicing and phylogenetic tree construction, and analyze the genetic evolution characteristics and resistance of influenza virus genes. Results 1. Epidemiological surveillance results: From 2016 to 2018, 19 sentinel hospitals in Inner Mongolia Autonomous Region reported a total of 235,804 influenza-like cases (ILI). The total number of outpatient and emergency outpatient clinics during the same period was 1,090,297. The percentage of influenza-like cases (ILI%) in total outpatient and emergency visits was 2.33%. 35,981 ILI samples were tested in 15 influenza surveillance network laboratories, of which 4728 were positive samples, with a positive rate of 13.14%. The distribution of ILI% in each year of Inner Mongolia Autonomous Region from 2016 to 2018 varies with time. The first peak of ILI% in each year appears between the first week to the 12th week in spring, and the second peak occurs in the 46th week in winter. Between the 52nd week. The first two age groups of ILI are the 0-year-old group and the 5-year-old group, while the lowest age group is the 15-year-old group. ILI distribution, influenza-like cases in the Midwest are higher than in the East. 2. Etiological monitoring results: from 2016 to 2018, a total of 35,981 throat swab samples of ILI cases were collected in Inner Mongolia, of which 4728 were positive samples, the positive rate was 13.14%; the positive rate difference in different years wa s statistically significant (χ2 = 60.717, P ﹤ 0.05). There was no significant difference in the positive rate of nucleic acid detection between different genders (χ2 = 2.293, P> 0.05). The distribution of regions with a high positive rate of nucleic acid detection is basically consistent with the distribution of ILI regions. The distribution of major pandemic strains varies from year to year. In 2016, the main epidemic strain was influenza B virus. In 2017, the main epidemic strains were seasonal H3N2 influenza virus and neo-A H1N1 influenza virus. Among them, the seasonal H3N2 influenza virus has a very strong epidemic intensity, and the main strains in 2018 were type B and new A H1N1 influenza viruses. 3. Genetic evolution analysis results: HA genes of 10 new influenza A H1N1 influenza viruses sequenced in this study from 2016 to 2018 and 2009 isolates, vaccine strains A / Michigan / 45/2015, country in this region The representative strain A / Sichuan / 1/2009 belongs to different branches, but is more related; the NA gene belongs to the same branch; 5 seasonal H3N2 influenza virus isolates belong to the same branch as the vaccine strain, but they are in line with the 2009 Inner Mongolia seasonal H3N2 Isolates belong to different branches. 4. Results of drug resistance analysis: The resistance of 39 new H1N1 influenza viruses and 6 seasonal H3N2 influenza viruses in Inner Mongolia in 2018 was tested, and the results showed that among 39 new H1N1 influenza virus strains Only one strain is HRI (sensitivity to test drugs is greatly reduced), and the remaining 38 strains are NI (sensitivity to test drugs). Conclusions 1. The incidence of ILI in Inner Mongolia Autonomous Region in 2016-2018 has a clear time pattern, and it is easy to be high in winter and spring; the epidemic intensity of influenza in the central and western regions is higher than that in the eastern region; Influenza prevention and control in infants and preschool children. 2. In 2016-2018, various influenza virus subtypes were mixed. Except for seasonal H1N1 viruses, other virus subtypes have become epidemic strains. 3. In this study, the HA and NA genes of the new H1N1 influenza virus isolates were located in different branches of the phylogenetic tree from our 2009 isolates. They are located on different branches of the phylogenetic tree from the newly recommended influenza vaccine strains of WHO, which indicates that the new influenza A (H1N1) virus in our region in 2018 may be more mutated than before. It is necessary to strengthen influenza surveillance to prevent the occurrence of influenza. There was no significant variation in seasonal H3N2. 4.Inner Mongolia Autonomous Region＇s 2018 influenza virus showed high sensitivity to neuraminidase inhibitor drugs, but resistance testing needs to be strengthened . Key Words: Influenza; epidemiology; etiology; gene; resistance Directed by: Guo Wei Dong. Applicant for Master degree: Guo Yan Hui. 1 前言 1.1 流行性感冒的提出 流行性感冒，简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道感染的疾病。由于流感是一种呼吸道传染病，所以它的主要传播方式是通过飞沫传播，正因如此才导致流感具有极强的传染性，所以世界卫生组织把它列为法定传染病的首位。因此流感也是首个受到全球性监测的传染病[1]。另一方面，由于流感病毒基因复杂，存在高度可变性，人群通常容易感染该病毒，这很可能导致重复感染和高发病率且可以在世界范围内造成广泛传播和流行。流感不同于其他普通的感冒，由于其总是突然发生，或可能导致轻度或重度的疾病，严重时甚至可能导致死亡，给人类和社会造成一定的经济负担。回顾世界历史上发生的四次流感大流行，均给人类社会造成了不同程度的死亡负担和巨大的财产经济损失[2-4]。流感的临床症状包括轻度上呼吸道症状到急性呼吸窘迫综合征，多器官衰竭甚至死亡[5]。一般情况下患有流感的人通常会出现上呼吸道的一些卡他性症状：咳嗽、喉咙痛、流鼻涕或鼻塞、发烧，有些人还会出现肌肉酸痛。但流感是具有自限性的，大多数患者可以在一周内治愈，但对于高危人群（如婴儿和老年人）来说，由于流感容易导致一些其他并发症，很容易引起其他一些严重疾病，甚至导致死亡[6]。

1.2 研究背景和意义 流感的流行主要就是由于流感病毒的变异造成的结果。流感病毒是一种RNA病毒且具有包膜，呈负向单链。它属于正粘病毒科，流感病毒属，流感病毒基因组分别由八个分段的RNA片段组成[7]。

流感病毒根据其核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的不同特征可以分为三类：甲型流感病毒（A），乙型流感病毒（B）和丙型流感病毒（C）[8]。对于甲型和乙型流感病毒来说，它们各自包含了8个RNA流感病毒片段，而丙型流感病毒则仅仅包含了7个RNA片段[9]。目前，甲型流感病毒和乙型流感病毒是世界上主要的流感流行毒株，甲型流感病毒基因易于突变，因此全世界的流感大流行通常是由甲型流感病毒引起的，主要的流行亚型是甲型H1和季节性H3。而乙型流感病毒则极易引起局部爆发，主要的亚型是B型Victoria系和B型Yamagata系。流感病毒基因容易在一定条件下发生变异，变异方式主要有两种，一种主要是通过抗原漂移(Antigenic—drift)来实现的，一种则是抗原转换(Antigenic—shift)[10]。

流感活动具有明显的季节性。由于不同地区的地理位置和气候条件不同，流感的活动周期也有所不同[11]。在全球范围内，北半球国家（例如美国和其他国家）的流感活动显示典型的冬季高峰。对于我国而言，由于我国幅员辽阔，南北气候条件大不相同，气候条件复杂。

因此，流感活动的季节性因地区而异。一般而言，北部地区流感的流行季节主要发生在冬季和春季。对于南部省份的城市，全年都会发生流感病例[12]。另一方面，我国流感的活动还存在一定的周期性，但流行规律随地区不同而不同[13]。我国流感新亚型整体呈现最先在南方出现，然后逐渐向北的趋势[13]。我国流感高危人群是“ 0-5岁人群”，这表明儿童和青少年患流感的风险很高，亦是防控的重点人群[14] 。

对于一种具有高度传染性且容易导致严重后果的疾病来说，疾病的预防与控制，传染病的监测发挥着不可替代的作用[14]。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)为了更好地做好流感的预防和控制工作，于1952年成立了全球流感监测网络(The Global Influenza Surveillance Network)，并且率先开创了传染病的全球性同步监测的先例[15]。当前有113个国家拥有全球流感监测网络，这进一步扩大了全球流感监测和应对系统[16]。流感监测系统中有四个基于世卫组织的实验室，分别位于美国，日本，英国和澳大利亚[15]。世界卫生组织流感合作中心通过各个国家的流感监测中心收集世界各地的流感信息和流行毒株，并作进一步总结和分析。根据分析结果，制定了全球流感预防和控制政策，以保护民众的生命健康和安全[15]。各种研究已显示流感的病例监测数据可有效反映流感病毒的活动和变化模式[16-17]流感监测不仅可以了解流感的流行趋势，而且可以及时预测流行趋势，及时发现流感病毒的新变种，为流感流行的早期预警和预测提供依据，是预防流感爆发的重要手段。目前，中国已经建立了较为完善的流感监测网络，覆盖了全国31个城市，为中国的流感监测技术提供了强大的平台[18]。自2009年加入国家流感监测技术平台以来，内蒙古自治区一直在不断发展。目前，我区有19家流感监测哨点医院和15家流感网络实验室。

此次研究的目的是了解内蒙古2016年至2018年流感样病例的流行病学特征和流感病毒基因病原学特点，掌握我区流感流行规律和流感病毒变异规律，了解流感病毒的遗传进化关系，为进一步评估流感流行株在人群中发生暴发流行提供疫情的预防和控制指导依据，同时指导疫苗的接种工作。

2 材料与方法 2.1 流感样病例流行病学监测 2.1.1 监测对象 流感样病例(Influenza-Like Illness，ILI)：指具有发热(体温≥38℃)，伴咳嗽或咽痛症状之一，并缺乏其他实验室确定诊断依据的病例。

2.1.2 资料来源 2016-2018年内蒙古自治区流感样病例监测数据来源于“中国疾病预防控制信息系统”子系统“中国流感监测信息系统”。覆盖全区12盟市，包括19家哨点医院和15家流感网络实验室上报数据。

2.1.3 统计分析方法 描述内蒙古自治区在不同时期，不同地区和不同人群中的ILI分布。运用Office Excel2010进行数据的收集，汇总，使用SPSS软件进行统计分析，P＜0.05。通过NCBI网站上的Blast比较验证获得的基因序列，并使用MEGA6.0软件绘制基因进化树，并分析其遗传进化特征。对这些菌株进行分析，并与WHO推荐的疫苗毒株进行比较，并分析遗传特征，例如遗传，抗原性和耐药性。

2.2 实验室检测 2.2.1 核酸检测 2.2.1.1 试剂与设备 One-Step RT-PCR试剂盒；
分子级无菌水；
正反向引物；
探针；
阳性对照RNA。离心机；
Vortex仪；
Real-time PCR仪。

2.2.1.2 核酸检测步骤 1. 引物融化、振荡、离心后放置在低温装置上。

2.将RT-PCR Enzyme Mix放置在低温装置上，融化5×RT-PCR Buffer，颠倒混匀。短暂离心5×RT-PCR Buffer后放置在低温装置上。

按照如下组分配制反应体系：
组 分 体 积（μL）
5×RT-PCR Buffer 5×n 10mM dNTP Mixture 1×n RT-PCR Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n RNase Free Water 11.9×n Total 20×n 3.将反应液混匀分装，每管20μL做好标记。

4.将分装好的PCR小管分别加入模板。按照先加阴性对照，再加标本，最后加阳性对照，每管5μL。

5.将备好反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增，反应程序见下表：
温度 时间（分钟：秒）
循环数 60° 10：00 1 42° 10：00 1 50° 30：00 1 95° 15：00 1 94° 00：30 40 50° 00：30 72° 01：00 72° 10：00 1 4° µ 2.2.2 MDCK细胞培养 2.2.2.1 试剂与设备 试剂：1.生长成片的MDCK细胞；

2.T-75细胞培养瓶，颈口有倾角；
3.DMEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺）；
4.青、链霉素母液（Gibco CatNo. 15140-144）（ 10,000U/mL青霉素G；
10,000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃；
5.HEPES缓冲液（Gibco CatNo. 10010-025），1M母液（Gibco CatNo. 15630-120）；
6.胎牛血清（Excell CatNo. FND700）；
7.EDTA-胰酶（如0.05％胰酶；
0.53mMEDTA·4Na）（Gibco，Cat No. 25300-062），分装后保存于-20℃；
8.牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液（Gibco，Cat No. 15260）；
9.1mL和10mL无菌移液管等，70％～75％的酒精。

仪器：1.Thermo CO2培养箱；
2.OLYMPUS IX51倒置显微镜；
3.Eppendorf移液枪、微量移液器；
4.BSL-2生物安全柜等。

2.2.2.2 步骤 1. 从细胞已生长成切片的细胞培养瓶中弃去培养基，并加入5 mL预热的EDTA-胰蛋白酶。

2. 轻轻摇动细胞瓶1分钟，以使EDTA-胰蛋白酶均匀地分布在整个细胞薄层中，然后用移液管吸去EDTA-胰酶。

3. 重新加入5mL37℃预热的EDTA-胰酶，重复上述步骤。

4. 加入1mLEDTA-胰蛋白酶使其均匀分布在整个细胞薄层中。在37℃下孵育细胞瓶，直到细胞与细胞瓶的塑料表面分离（约5min〜10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。

5. 加入9mL细胞生长溶液，轻轻移动移液器以吹散细胞团，然后从培养瓶底部吹至另一端。确保将所有底部吹到底部，轻柔地运动以免产生泡沫。

6. 移液后，将90 mL细胞生长溶液（细胞悬液的浓度约为每毫升105个细胞）添加到瓶中，培养液的最终浓度为10％胎牛血清。将6 mL（6 x 105 / mL细胞）细胞悬液添加到每个T-25细胞培养瓶中，并将剩余的细胞悬液添加到另一个T-75细胞瓶中作为细胞传代的种子。

通常情况下，6mL细胞悬液可在2-3天内成长为80％〜90％的单层细胞。

7. 在37°C 5％CO2培养箱中培养细胞，每天观察细胞状态。

2.2.3 流感病毒分离 2.2.3.1 材料 1. 试剂：1.75～90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶；
2.TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（Sigma，T8802）；
3.HEPES缓冲液，1M母液；
4.DMEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺）；
5.青、链霉素母液（10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素）；
6.牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（北京友康7.5%BSA-V）；

7.PH7.4的PBS缓冲液；
8.处理好的临床标本0.5~1mL；
9.1mL和10mL无菌移液管等。

2. 培养基：1.500mLDMEM液中加入：1)青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素）；
2）牛血清白蛋白组分V 12.5mL（终浓度：0.25％)；
3)HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）；
3)7.5%的NaHCO3溶液（所加NaHCO3溶液体积为总体积的2-3%）；
2.病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL（1‰）的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。

2.2.3.2 步骤 1. 75～90％成片细胞的准备：（1）用40倍光学显微镜观察细胞生长。在对数生长阶段选择MDCK细胞进行病毒隔离；
（2）轻轻倒出细胞生长溶液，并用10 mL无菌移液器用6 mL PBS缓冲液洗涤细胞3次。

2. 接种于细胞培养瓶：（1）用无菌移液管从细胞培养瓶中移出洗涤细胞的PBS缓冲液；
（2）用无菌移液管将0.5〜1mL临床样品吸移至细胞培养瓶中，并轻轻摇动。其次，使其均匀地铺在细胞培养瓶底部；
（3）将步骤（2）中的培养瓶放入35℃，5％CO 2的培养箱中1至2小时；
瓶中用10mL无菌移液管吸移6mL PBS缓冲液洗涤细胞，向细胞培养瓶中加入终浓度为2μg/ mL TPCK-胰蛋白酶的5mL病毒生长液。

腔室培养，每日观察到的细胞病变情况（细胞病变的特征是细胞肿胀和变圆，细胞间隙增加成网状结构，细胞核缩小或破裂，严重时细胞脱落。

3. 细胞培养物的收获：（1）当75％～100％细胞出现病变时进行收获。即使无细胞病变也应该于第7天收获；
（2）进行红细胞凝集试验（HA），并通过HI方法鉴定流感病毒。接种后，阴性样本需要传播一次。对于HA <8的细胞分离株，将其稀释10-1至10-3，然后重新感染细胞以继续细胞传代。直到HA≥8，才可以通过HI方法进行病毒处理。经连续传代2次以上，HA<8者，可以用核酸检测方法鉴定分型。

2.2.4 红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 2.2.4.1 仪器与试剂 1. 试剂：（1）标准参照抗原：将国际疫苗株和国内流行株用作标准参照抗原，将新分离的株用作试验抗原。（2）标准参考抗血清：以国际疫苗株和国内流行株制备的抗血清为标准参考血清。血清要经过RDE进行处理。

2. 仪器：（1）水浴箱（37℃，56℃）；
（2）台式离心机多道可调加样器、单道可调加样器；
（3）离心管；
（4）96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板）；
（5）200µL、1000µLTIP头、水槽；
（6）.BSL-2生物安全柜等。

2.2.4.2 红细胞配置 1. A.S解决方案称为Alsever解决方案。制备方法为：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，去离子水100ml，稍加加热使其溶解，将pH调至6.1，用8磅高压釜灭菌20min；

2. 离心含有红细胞的A.S溶液5分钟（火鸡/鸡红细胞为1800 rpm；
人“ O”型，豚鼠红细胞为2000 rpm，不同离心机的速度略有不同），弃去上清液；

3. 加入相同量的PBS缓冲液进行洗涤，混合均匀，离心5分钟（与上述速度相同），弃去上清液。用PBS缓冲液洗涤3次。最后一次洗涤后，离心10分钟（与上述相同的速度），弃去上清液；

4. 吸出适量的红细胞，并用PBS缓冲液配制1％工作浓度的红细胞悬液。

2.2.4.3 流感毒株HA滴度的测定 1. 微量血凝板的第2～12列加入50ul PBS（PH7.4）；

2. 第一列每孔中加入100ul病毒悬液；

3. H1加入100ul PBS，作为红细胞阴性对照；

4. 用第一列的行枪从每个孔中抽出50ul病毒溶液，并从1到12列进行2倍系列稀释。

丢弃最后一列中的50ul；

5. 向每个孔中添加50ul红细胞悬液，轻拍并混合均匀，并在室温下孵育1小时。

6. HA试验结果判断：红细胞全部凝集以“+”记录；
只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；
无凝集记录“-”。出现完全凝集的最高稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。

2.2.4.4 红细胞凝集抑制试验（HI）
1. 在血凝板的每孔加入25ul PBS。然后在A1—A5、A7—A11各列分别加入：抗季节性A(H1N1)流感病毒标准参考血清、抗季节性A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清、抗新甲型H1N1流感病毒标准参考血清25ul，A6、A12加入25ul PBS，作为阴性对照。用排枪从第一行每个孔吸取25ul液体，由第一行至第八行做2倍稀释血清，最后一行每孔弃去25ul。

2. A1至A5各列每孔加入25ul待检抗原（4个血凝单位）阳性对照：A7至A11 各列分别加入4个血凝单位的季节性A(H1N1)流感病毒标准参考抗原、季节性A(H3N2)流感病毒标准参考抗原、B-Yamagata系流感病毒标准参考抗原、B-Victoria系流感病毒标准参考抗原、新甲型H1N1流感病毒标准参考抗原各25ul/孔。对照孔A6、A12各列加入25ul PBS/孔。轻拍混匀，室温孵育30min。

3. 向每个孔中添加50ul红细胞悬液，轻轻拍打，混合并在室温下孵育30-60分钟，以观察结果。当完全抑制血凝形成时，血凝抑制滴度是血清最高稀释度的倒数[19]。

2.3 基因测序 选择不同年份，地区和亚型的流感病毒株进行测序。

测序将由专业技术公司完成。

2.4 流感病毒的耐药性检测 选择至少30株经过抗原性分析的流感病毒株进行耐药性测试，并使用表型方法监测流感病毒的耐药性，并为指导抗流感病毒药物的使用提供依据。具体检测内容由中国疾病预防控制中心负责完成。

3 结果 3.1 流行病学监测结果 3.1.1 总体概况 2016-2018年，内蒙古自治区的19家哨点医院共报告了235804例流感样病例（ILI）。同期的门诊和急诊门诊总数为1090297。流感病例在总的门诊和急诊就诊中所占的百分比（ILI％）为2.33％。各年度ILI%差异有统计学意义（χ2=591.151，P﹤0.05）。在15个流感监测网络实验室中检测了35981个ILI样本，其中4728个为阳性样本，阳性率为13.14％。（见表1）。

表1 2016-2018年度内蒙古自治区各年度ILI%（样本阳性率）
Tab1 Inner Mongolia Autonomous Region 2016-2018 ILI%(sample positive rate) 年份 流感样病例 门急诊病例 ILI比例 采集 阳性 阳性率 总数 就诊总数 (%) 样本数 样本数 （%）
2016 68665 3169259 2.17 12142 1683 13.86 2017 80877 3364872 2.40 11988 1720 14.35 2018 86262 3556166 2.43 11851 1325 11.18 合计 235804 10090297 2.33 35981 4728 13.14 3.1.2 时间分布 内蒙古自治区2016-2018年各年度ILI%随时间分布情况不同。2016年在第6周、第12周出现明显高峰，峰值为4.12%，2016年ILI流行时间集中于第5-13周，之后的流行趋势趋于平缓；
2017年在第49-52周出现明显流行高峰，峰值为5.49%，2017年ILI开始处于平缓的低流行态势，年终呈现“突起”态势；
2018年流感样病例（ILI）共86262例，ILI%均值为2.43%，以周为单位，ILI%波动范围在1.73%-5.36%之间。本年度出现两个流感高峰，分别为第1周（4.44%）和第52周(5.36%)，最低为第33周，数值为1.73%。

图1 2016年内蒙古自治区ILI时间分布复合图 图2 2017年内蒙古自治区ILI时间分布复合图 图3 2018年内蒙古自治区ILI时间分布复合图 3.1.3 人群分布 内蒙古自治区2016-2018年度ILI构成居前两位的是0～岁组和5～岁组，两组合计占比均达到各年度总ILI数的80%以上；
居第三位、第四位的分别为25～岁组、60～岁组；
构成比排位最后的年龄组均为15～岁组。（见表2）
表2 内蒙古自治区2016-2018年ILI年龄构成 Tab2 Inner Mongolia Autonomous Region ILI age composition 2016-2018 年龄组 （岁）
2016年 2017年 2018年 合计 ILL 构成比 例数 （%）
ILI 构成比 例数 （%）
ILI 构成比 例数 （%）
ILI 构成比 例数 （%）
0~ 41378 60.26 48797 60.26 51332 60.33 141507 60.00 5~ 16621 24.21 19205 24.21 20178 23.75 56004 23.72 15~ 1713 2.49 2613 2.49 2897 3.23 7223 3.07 25~ 6188 9.01 7603 9.01 9169 9.40 22960 9.74 60~ 2768 4.03 2659 4.03 2686 3.29 8113 3.44 合计 68665 100.00 80877 100.00 86262 100.00 235807 100.00 3.1.4 地区分布 内蒙古地区幅员辽阔，分为东、中、西三个地区。2016-2018年，东部地区ILI%为1.73%，中部地区ILI%为3.23%，西部地区ILI%为2.30%。

三个地区ILI%差异有统计学意义（χ2=15839.625，Ρ<0.05）。（见表3）
3.2 病原学监测 3.2.1 总体情况 2016年至2018年，共从内蒙古自治区19家哨点医院采集了35981例ILI病例的咽拭子样本，其中阳性样本4728例，阳性率为13.14％。不同年份的阳性率有统计学差异（χ2 = 60.717，P 0.05），2016年和2017年的阳性率显着高于2018年。阳性样本型别包括乙型（1825份，38.60%）、季节性H3N2（1424份，30.12%）、新甲型H1N1（1460份，30.88%）、混合型（19份，0.40%），其中混合型只在2017年和2018年以较低检出率出现，季节性H1N1各年度均未检出。（见表4）
3.2.2 优势株变化 内蒙古自治区2016-2018年每年的优势株分布各不相同。2016年，主要毒株是乙型流感病毒。2017年，主要毒株为季节性H3N2和新甲型H1N1流感病毒。其中，季节性H3N2流感病毒流行强度较强，而2018年的主要毒株为乙型和新甲型H1N1流感病毒。

3.2.3 性别分布 内蒙古自治区2016-2018年监测采集ILI样本男女性别比为1.13：1（男性53.08%，女性46.92%）。不同性别核酸检测阳性率差异无统计学意义（χ2=2.293，P>0.05）。（见表5）
3.2.4 地区分布 在东部地区总共检测了11178个样本，其中1003个样本为阳性，阳性率为9.00％。在中部地区共检测了12636例，阳性1485例，阳性率为11.75％。西部地区共检测了12167例，阳性1664例，阳性率为13.68％。三个地区的阳性率差异具有统计学意义（χ2=127.114，Ρ<0.05）。（见表6）
表3 内蒙古自治区2016-2018年ILI地区分布 Tab3 Regional distribution of ILI in Inner Mongolia Autonomous Region from 2016 to 2018 地区 2016年 2017年 2018年 合计 ILI 病例数 门诊 就诊数 ILI率（%）
ILI 病例数 门诊 就诊数 ILI率（%）
ILI 病例数 门诊 就诊数 ILI率（%）
ILI 病例数 门诊 就诊数 ILI率（%）
东部 13801 1119674 1.23 20388 1191416 1.71 31839 1500068 2.12 66028 3811158 1.73 中部 26174 700574 3.74 34808 864697 4.02 27076 1152596 2.35 88058 2717867 3.23 西部 28690 1349011 2.13 25681 1308759 2.00 27347 903502 3.03 81718 3561272 2.30 合计 3169259 68665 2.17 80877 3364872 2.40 86262 3556166 2.43 235804 10090306 2.34 表4 内蒙古自治区2016-2018年流感病毒阳性样本构成[份（%)] Tab4 Composition of influenza virus positive samples in Inner Mongolia Autonomous Region in 2016-2018 [parts (%)] 年份 检测 样本数 阳性样本型别 阳性率 乙型 季H3N2 新甲H1N1 混合型 合计 （%）
2016 12142 923（54.84）
539（32.03）
221（13.13）
0（0.00）
1683（100.00）
13.86 2017 11988 326（18.95）
730（42.44）
657（38.200）7（0.41）1720（100.00）
14.35 2018 11851 576（43.47）
155（11.70）
582（43.92）
12（0.90）1325（100.00）
11.18 合计 35981 1825（38.60）1424（30.12）1460（30.88）19（0.40）4728（100.00）
13.14 表5 内蒙古2016-2018年ILI样本不同性别阳性率比较 Tab5 Comparison of positive sex ratios of ILI samples in Inner Mongolia from 2016 to 2018 性别 2016年 2017年 2018年 合计 检测 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
检测 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
检测 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
检测 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
男 6444 867 13.45 6320 867 13.72 6334 424 7.00 19098 2158 11.30 女 5698 816 14.32 5668 853 15.05 5517 325 6.00 16883 1994 11.81 合计 12142 1683 13.86 11988 1720 14.35 11851 749 6.32 35981 4152 11.54 表6 内蒙古2016-2018年ILI样本不同地区阳性率比较 Tab6 Comparison of positive rates of ILI samples in different regions of Inner Mongolia from 2016 to 2018 地区 2016年 2017年 2018年 合计 采集 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
采集 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
采集 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
采集 样本数 阳性 样本数 阳性率（%）
东部 3479 330 9.50 3566 440 12.34 4133 233 5.64 11178 1003 9.00 中部 4736 802 16.93 4202 498 11.85 3698 185 5.00 12636 1485 11.75 西部 3927 551 14.03 4220 782 18.53 4020 331 8.23 12167 1664 13.68 合计 12142 1683 13.86 11988 1720 14.35 11851 749 6.32 35981 4152 11.54 3.3 抗原分析 2018年对132株H1N1（pdm）流感病毒进行抗原性分析，其中128株为A/Michigan/45/2015(H1pdm)的类似株，4株为A/Michigan/45/2015(H1pdm)的低反应株。对6株A(H3N2) 流感病毒进行抗原性分析，其中5株为A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016(H3N2)的类似株，1株为A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016(H3N2)的低反应株。（见表7）
表7 流感病毒抗原分析 Tab7 Influenza virus antigen analysis 流感病毒 抗原分析 合计(株) 类似株 低反应株 新甲型H1N1 128 4 132 季节性H3N2 5 1 6 3.4 流感病毒全基因同源性分析 3.4.1 新甲型H1N1全基因同源性分析 以世界卫生组织推荐的疫苗株A / California / 7/2009为标准，对2018年内蒙古自治区5种新甲型H1N1流感病毒毒株全基因组序列进行核苷酸同源性分析。结果表明，所有毒株的八个基因片段与疫苗株的核苷酸同源性在99.7％-99.9％。（见表8）
表8 新甲型H1N1同源性分析 Tab8 New type A H1N1 homology analysis 流感毒株 A/California/7/2009 ( Identities % ) PB2 PB1 PA HA NP NA M NS A/内蒙古科尔沁/SWL1883/2018(H1) 99.9 99.9 99.9 99.7 99.7 99.7 99.2 99.4 A/内蒙古阿拉善左旗/SWL1575/2018(H1) 99.6 99.7 99.8 98.7 99.3 99.7 99.5 99.2 A/内蒙古回民/SWL118/2019(H1) 99.7 99.7 99.6 99.5 99.3 99.7 99.4 98.9 A/内蒙古锡林郭勒/SWL185/2019(H1) 99.5 99.6 99.0 98.3 99.6 99.7 99.2 99.1 A/内蒙古临河/SWL1582/2018(H1) 99.9 99.8 99.5 99.4 99.6 99.7 99.0 99.1 3.4.2 季节性H3N2全基因同源性分析 以WHO推荐的A / Victoria / 74/2018（H1N1）疫苗株为标准，对内蒙古自治区2018年5株季节性H3N2流感病毒毒株的全基因组序列进行核苷酸同源性分析。结果发现，所有毒株的8个基因节段与疫苗株的核苷酸同源性在97.7%-99.9%之间。（见表9）
表9 季节性H3N2同源性分析 Tab9 Seasonal H3N2 homology analysis 流感毒株 A/Victoria/74/2018(H3N2) ( Identities % ) PB2 PB1 PA HA NP NA M NS A/内蒙古海勃湾/1573/2018(H3) 99.7 99.5 99.5 99.4 99.4 99.7 99.3 99.8 A/内蒙古海勃湾/1586/2018(H3) 99.6 99.5 99.5 99.4 99.3 99.4 99.5 99.2 A/内蒙古科尔沁/1849/2018(H3) 99.8 99.7 99.7 99.6 99.4 99.7 99.3 99.7 A/内蒙古海勃湾/1591/2018(H3) 99.7 99.6 99.6 99.5 99.5 99.4 99.4 99.6 A/内蒙古科尔沁/1805/2018(H3) 99.9 99.8 99.8 99.7 99.7 99.7 99.6 99.4 3.4.3 流感病毒基因序列及进化树分析 3.4.3.1 新甲型H1N1流感病毒HA基因进化树分析 对内蒙古自治区2018年10株新甲型H1N1流感病毒分离株的HA基因进行测序和系统进化树构建，流感病毒毒株的HA病毒基因测序位于同一分支。其中A/Neimenggu-donghe/SWL1472/2018与A/Neimenggu-donghe/SWL514/2018属于同一分支；
A/Neimenggu-dongsheng/SWL1602/2018 与A/Neimenggu-keerqin/SWL1883/2018属于同一分支；
A/Neimenggu-alashanzuoqi/SWL1575/2018与A/Neimenggu-alashanzuoqi/SWL1597/2018属于同一分支；
A/Neimenggu-xilinggule/SWL1852019、A/Neimenggu-haibowan/SWL1617/2018、A/Neimenggu-huiming/SWL118/2019、A/Neimenggu-linhe/SWL1582/2018属于同一分支。结果同时显示：同一分支的分离株侧枝相近，说明分离株HA基因替换率较低；
另一方面，新推荐疫苗株与分离株不属于一分支，与2009年内蒙古疫苗株属于不同分支。此次新甲型H1N1流感病毒分离株与我国国家代表株A/Sichuan/1/2009虽不属于同一分支，但亲缘性较高。(见图4) 图4 新甲型H1N1流感病毒HA基因系统进化树 注: ▲分离毒株 ●疫苗株 ♦中国代表株；
分支处的数字是 Bootstrap检验的可信度；
标尺值 0.005 代表单位长度内核苷酸差异水平。

3.4.3.2 新甲型H1N1流感病毒NA基因进化树分析 对内蒙古自治区2018年10株新甲型H1N1流感病毒分离株进行NA基因测序并构建系统进化树，测序的流感病毒毒株NA基因均位于同一分支。其中A/Neimenggu-keerqin/SWL1883/2008与A/Neimenggu-dongsheng/SWL1602/2008属于同一分支；
A/Neimenggu-dongsheng/SWL1472/2008与A/Neimenggu-keerqin/SWL1514/2008属于同一分支；
A/Neimenggu-huimin/SWL118/2008与A/Neimenggu-haibowan/SWL1617/2008、A/Neimenggu-linhe/SWL1582/2008属于同一分支；
A/Neimenggu-alashanzuoqi/SWL1575/2008与A/Neimenggu-alashanzuoqi/SWL1597/2008属于同一分支；
A/Neimenggu-xilinguol/SWL185/2008属于一分支。结果同时显示:此次分离毒株与新推荐疫苗株A/Michigan/45/2015属于同一分支，与国家推荐株虽然属于同一分支，但亲缘性不高。（见图5）
图5 新甲型H1N1流感病毒NA基因系统进化树 注: ▲分离毒株 ●疫苗株 ♦中国代表株；
分支处的数字是 Bootstrap检验的可信度；
标尺值 0.005 代表单位长度内核苷酸差异水平。

3.4.3.3 季节性H3N2流感病毒HA基因进化树分析 对内蒙古自治区2018年5株季节型H3N2流感病毒分离株进行HA基因测序并构建系统进化树，测序的流感病毒毒株HA基因均位于同一分支。其中A/Neimenggu-haibowan/1573/2018、A/Neimenggu-haibowan/1591/2018、A/Neimenggu-haibowan/1586/2018属于同一分支；
A/Neimenggu-keerqin/1805/2018、A/Neimenggu-keerqin/1849/2018各属于一分支。结果同时显示：5株分离株与疫苗株属于同一分支，但与内蒙古2009年季节性H3N2毒株分属不同分支，提示病毒可能较2009年存在变异。（见图6）
图6 季节性H3N2流感病毒HA基因系统进化树 注: ▲分离毒株 ●疫苗株 ♦中国代表株；
分支处的数字是 Bootstrap检验的可信度；
标尺值 0.002 代表单位长度内核苷酸差异水平。

3.4.3.4 季节性H3N2 流感病毒NA基因进化树分析 对内蒙古自治区2018年5株季节型H3N2流感病毒分离株进行NA基因测序并构建系统进化树，测序的流感病毒毒株NA基因均位于同一分支。其中A/Neimenggu-haibowan/1573/2018、A/Neimenggu-haibowan/1591/2018、A/Neimenggu-haibowan/1586/2018属于同一分支；
A/Neimenggu-keerqin/1805/2018、A/Neimenggu-keerqin/1849/2018各属于一分支。结果同时显示：
5株分离株与疫苗株属于同一分支，但与内蒙古2009年季节性H3N2毒株分属不同分支，提示病毒可能存在变异。（见图7）
图7 季节性H3N2流感病毒NA基因系统进化树 注: ▲分离毒株 ●疫苗株 ♦中国代表株；
分支处的数字是 Bootstrap检验的可信度；
标尺值 0.005 代表单位长度内核苷酸差异水平。

3.5 流感病毒耐药性分析 对于流感的治疗，目前有疫苗接种和抗病毒治疗两种方法。主要有两种用于抗病毒治疗的药物，一种类型是烷胺类药物即M2离子通道抑制剂，包括金刚烷胺和金刚乙胺。这些药物仅影响甲型流感病毒，对乙型和丙型流感病毒无效；

另一种是神经氨酸酶（NA）抑制剂，例如奥司他韦。对2018年内蒙古39株新甲型H1N1流感病毒和6株季节性H3N2流感病毒进行了耐药性测试。结果表明，39株新甲型H1N1流感病毒毒株中只有一株是HRI（对测试药物的敏感性大大降低）， 其余38株为NI（对测试药物敏感）；
6种季节性H3N2流感病毒株均为NI（对测试药物敏感）。（见表10）
表10 流感病毒耐药性分析 Tab9 Analysis of influenza virus resistance 流感病毒 耐药检测 合计(株) NI HRI 新甲型H1N1 38 1 39 季节性H3N2 6 0 6 4 讨论 4.1 流行病学监测分析 4.1.1 时间分布 根据ILI年度监测结果，内蒙古自治区2016-2018年流感病毒的时间监测显示，2016-2018年ILI％有所不同。这种情况表明，不同年份的流感流行特征不同，流行时间趋势明显[20]，流行性感冒流行强度与时间密切相关。2016-2018年ILI监测结果显示，流感流行的第一个高峰发生在1-13周之间，而第二个高峰则出现在冬季的第46周～第52周之间，此结果与我国北方地区例如北京流感容易在冬春季节高发，夏秋季节发生频率较低的流行时间特征是相同的，但是与中国南方（例如浙江）的两个冬春季节和春夏秋季节的流行季节规律略有不同[21]。此外在2016、2017年只在春季出现一次高峰，冬季则保持平稳的流行趋势，而在2018年的春季和冬季有两个高峰， 原因可能与全球气候变化有关。根据一些学者的研究，当外部环境的每周平均气压，风速，温度和累积日照时间减少时，患流感的风险将会增加，当相对湿度增加时流感发病风险也会升高，此发现进一步表明不同地区的地理位置、不同的气候条件是影响北部和南部流感流行的主要因素[22]。

4.1.2 地区分布 对2016-2018年度内蒙古自治区ILI监测结果按地区进行分析，内蒙古中、西部地区ILI%较高。分析其原因可能是内蒙古自治区处于我国北部，幅员辽阔，地势呈东西狭长型，而且由于东西跨度较大，气候差异十分明显。东部地区温度低，湿度高，而西部地区温度高，风速高，湿度低，因此气候差异可能是导致这一结果的原因；
此外由于各个地区的各种风俗习惯的不同以及就诊差异，存在流感监测工作不到位的情况。根据内蒙古自治区每年开展的对各地区流感监测的督导工作来看，各盟市地区流感监测的数据上报质量存在参差不齐的情况，这也可能是造成各地区ILI数和ILI%差异比较明显的一个重要原因。因此，这一结果也提示我们各个地区要加强流感的监测工作，以使得流感监测数据能够更加准确、及时。最后，流感监测不是全人群监测，是设立在哨点医院进行监测，流感地区分布不同也可能与哨点医院的数量和城市人口数有关。

4.1.3 人群分布 对内蒙古自治区2016-2018年度ILI监测结果进行分析，结果显示男女性别间ILI%差异不具有统计学意义，流感对于全人群普遍易感。从年龄构成情况来看，0～岁组和5～岁组为流感的高发人群，与其他学者万永虎[23]、温雯[24]、孙佰红[25]的研究结果一致。分析这一现象的原因可能是该年龄段人群处于幼儿和学龄前期，自身抵抗力较弱，而且经历的流感次数可能较少，累积的人群免疫率较低，另一方面该人群又经常活动在幼托等人群比较密集的场所，给流感的人群间互相传播提供了一定的有利条件 。因此，还建议我们应更加重视0至5岁儿童的流感样病例的监测工作，同时也应该加强对该人群的流感疫苗接种，促进对流感的预防和控制，与此同时也应该预防该人群的家庭成员感染流感病毒，及时推广流感疫苗知识，以减少该人群中的流感爆发数量，减少该年龄段流感样病例人数，降低出现大规模流感疫情的风险。此外，虽然60～岁组人群不是此次结果的高发人群，但该年龄组均为免疫力低下的老年人，发生流感容易引起其他系统的疾病，严重者甚至可以危及生命。所以，我们也应该加强对该人群的流感监测工作，进一步提高对该人群的流高关注度，减少流感的发生，降低其生命财产损失。

4.2 病原学分析 由于流感引起的临床症状大多都很相似，所以仅仅依靠临床表现很难判定流感病毒的型别。因此，对于流感病毒的鉴定分型就显得十分必要，而核酸检测方法就可实现对流感的诊断和流感病毒的鉴定分型[26-27]。通过对2016-2018年度内蒙古自治区流感病毒进行核酸检测，检测结果显示，2018年阳性率明显低于2016、2017年，分析原因可能是人群免疫力提高以及疫苗接种使得阳性率降低。根据之前内蒙古相关研究可知，自2013年以后，内蒙古地区并无季节性H1N1检出[28]，而2016-2018年度内蒙古自治区也无季节性H1N1检出，进一步分析其原因可能与环境气候变化、物种选择、人群免疫力的提高对流感病毒的影响以及流感病毒基因变异等相关因素有关，具体原因还有待进一步研究。内蒙古自治区2016年至2018年每年的优势毒株分布略有不同，2016年主要流行毒株是乙型流感病毒，2017年主要流行毒株是季节性H3N2流感病毒和新甲型H1N1流感病毒，其中季节性H3N2流感病毒具有很强的流行强度。而2018年的主要流行毒株是乙型流感病毒和新甲型H1N1流感病毒。从数据可以看出，内蒙古自治区2016-2018年流感病毒变化趋势呈相互交替变化，这也与其他学者的流感病毒在流行季节各亚型交替成为流行株的报告相同[29-30]。另外混合型只在2017年和2018年以较低检出率出现，进一步实验验证，结果仍为混合型，分析原因一方面可能是病毒存在变异，两种流感病毒同时感染一个宿主，导致流感病毒基因在个体间交叉互换所形成的的结果；
另一方面也可能是实验室人员在实验过程中没有严格遵守样品采集和实验章程，采集和运输标本的过程中出现交叉感染而导致这一结果。

内蒙古自治区流感病毒阳性检测率在男女性别间差异无统计学意义，这与Miyuki Kawado[31]等研究结果一致，说明流感病毒对于全人群来说普遍易感，没有性别间的差异。内蒙古自治区各盟市流感病毒阳性率差异具有统计学意义，其分布情况也与各地区ILI%分布情况一致，阳性率较高地区基本都集中在中、西部地区，这一结果进一步说明流感的发生与地理位置、气候环境等因素有关。

4.3 遗传进化分析 流感病毒属于正粘病毒科，根据其核蛋白（NP）和膜蛋白（M）的抗原特性及其相关基因特性的不同，将流感病毒分为甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）三型[32]。甲型和乙型流感病毒均含有8个RNA片段[32]，且每个片段都可以编码1-2个蛋白。其中甲型流感病毒根据其表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，又可以分为许多不同的亚型。血凝素（HA）现已知有18个不同的类型，而神经氨酸酶（NA）有11个不同的类型[33]。由于HA和NA可以相互组合，所以就形成了许多不同亚型的流感病毒。因此，这一现象也决定了不同的宿主可以感染不同的流感病毒，以及不同的流感病毒传染性也不尽相同[34]。

流感流行的主要原因就是血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不断变异，变异的形式主要有两种：抗原漂移和抗原转换[35]。对于HA来说，它容易发生点突变，当点突变导致的氨基酸变化积累到一定程度的时候，就会导致抗原位点的改变，与此同时也改变了流感病毒对于宿主机体的特异性，所以容易引起中小型的流感流行[36]。对于NA来说，它主要是发生抗原转换，使得流感病毒基因之间不用的片段互相发生重配，产生了新的亚型，容易引起流感的大流行[37]。

本次对2016-2018年度内蒙古自治区新甲型H1N1流感病毒HA基因测序所得的结果进行基因进化树分析，结果显示本次研究的分离株与我区2009年新甲型H1N1流感、疫苗株A/Michigan/45/2015、国家代表株A/Sichuan/1/2009分属于不同的分支，存在一定差异。这一结果说明内蒙古自治区近年来新甲型H1N1流感病毒HA基因较2009年已经发生了一定的基因变异，且产生了新的分支。新甲型H1N1流感病毒NA基因分析结果与HA分析结果不同，与我区2009年分离株、疫苗株、国家代表株属于同一分支，但亲缘性较低，说明WHO新推荐疫苗株对我区近年新甲型H1N1流感病毒没有较好保护性。

本次研究季节性H3N2流感病毒HA遗传进化分析结果显示，5株季节性H3N2流感病毒毒株与疫苗株A/New York/PV01536/2018属于同一分支，说明该疫苗株对我区季节性H3N2流感病毒具有保护作用,疫苗接种是预防流感最有效的措施；
但是与我区2009年分离株分属于不同分支，说明内蒙古自治区近年来季节性H3N2病毒HA基因较2009年已经发生了一定的基因变异，且产生了新的分支,提示我们要加强对于季节性H3N2流感病毒的监测工作。

而本次研究季节性H3N2流感病毒NA遗传进化分析结果与HA分析结果相近，分离的流感病毒毒株与疫苗株A/New York/PV01536/2018属于同一分支，说明该疫苗株对于内蒙古自治区季节性H3N2流感病毒具有保护作用。但是与我区2009年分离株分属于不同分支，与此同时也说明内蒙古自治区近年来季节性H3N2病毒NA基因较2009年已经发生了一定的基因变异，且产生了新的分支。

但是全球监测显示，推荐疫苗株与各型流感主要流行系谱之间正确匹配的概率仅有50%[6]，同时也有研究表明，当疫苗株与流行株不匹配时，流感病毒不同谱系感染机体后提供的交叉保护作用是有限的[11]。临床研究也表明，对于大多数人群来说四价流感疫苗具有较好的免疫保护效果[14]；
但是目前全球许多的国家和地区仍然以三价流感疫苗为主[13]。因此，在尚无通用流感疫苗的情况下，四价流感疫苗将成为全球流感疫苗发展的必然趋势。

中国还应促进四价流感疫苗的使用，为人民特别是高危人群提供有效的保护。

4.4 流感病毒抗原性分析 在流感病毒的8个节段中，分别编码着不同的蛋白，其中第4节段和第8节段分别编码血凝素蛋白和神经氨酸酶，而这两种蛋白又是构成流感病毒抗原性的主要成分。流感病毒HA蛋白内部含有4个抗原决定簇，包括：Sa(124-125,153-157,159-164);Sb(184-195);Ca(137-142,166-170,203-205,221-222,235-237);Cb(70-75)[36]。研究表明，如果抗原决定簇中的4个以上位点发生突变，且这些位点分布在不同的抗原决定簇上，表明新的抗原突变株将会出现[37]。2018年对132株新甲型H1N1流感病毒进行抗原性分析，其中128株为A/Michigan/45/2015(H1pdm)的类似株，4株为A/Michigan/45/2015(H1pdm)的低反应株。对6株季节性H3N2流感病毒进行抗原性分析，其中5株为A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016(H3N2)的类似株，1株为A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016(H3N2)的低反应株。当低反应株存在较多的话，就会使得抗原变异的的幅度增大，就会发生抗原性转变，形成新的亚型。此时，如果人群普遍缺乏对它的免疫力，往往会引起较大的流行，甚至世界性流行。而此次研究低反应株较少，说明内蒙古自治区近几年流感病毒抗原性未发生较大变异，不会导致流感的流行。但是，由于流感病毒基因具有高度的变异性，对于流感的监测工作必须随时开展，做到万无一失。

4.5 流感病毒耐药性分析 由于流感病毒基因变异性高，各亚型之间容易发生交叉互换，难以预测其进化趋势，导致流感疫苗对人群的有效保护时间短，流感疫苗不能很好地覆盖所有流感病毒型别[38-39]。因此对于流感的治疗来说，抗病毒药物治疗就显得尤为重要。而目前用于抗流感病毒治疗的药物主要有两种：一类是烷胺类药物，即M2离子通道通道抑制剂，包括金刚烷胺和金刚乙胺，该类药物仅作用于甲型流感病毒，对于乙型流感病毒和丙型流感病毒无效；
另一类是神经氨酸酶（NA）抑制剂，如奥司他韦、扎那米韦[40-42]。内蒙古自治区2018年对流感病毒的耐药性监测分析显示，大多数流感病毒对神经氨酸酶抑制剂表现出高度敏感性，只有一株流感病毒对检测药物的敏感性显着降低。从分离的流感病毒毒株的NA蛋白的催化位点和辅助位点的角度来看， 没有发现氨基酸取代。该结果表明，通过基因分析NA基因片段仍保持高度同源性，并且仍对流感神经氨酸酶抑制剂药物敏感[43]。分析原因可能是我区对于流感的疫苗接种工作做得比较到位，人群预防流感的意识也普遍提高，使得不再有大面积人群去服用抗流感病毒药物，但仍然需要加强对流感病毒耐药性的监测。此次研究奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂药物在预防和治疗新甲型H1N1流感病毒和季节性H3N2流感病毒中发生的耐药现象，是为了明确流感病毒产生的耐药机制，以此来指导我区医疗卫生系统如何合理和规范的使用抗流感病毒的药物，另一方面对于指导新甲型H1N1流感流行具有重要的意义[44]。

5 结论 1.2016-2018年度内蒙古自治区流感流行呈现冬春季流行的趋势，由于地理位置和气候条件的不同，中部和西部地区较东部容易发生流感。而对于人群来说。婴幼儿和学龄前期儿童是流感的高发人群，提示我们要做好该人群的流感监测和疫苗接种工作。

2. 在2016-2018年，内蒙古自治区混合流行了流感病毒亚型。除了未检测到季节性H1N1病毒外，其他病毒亚型也交替成为主要流行株。

3. 在此次研究中，新甲型H1N1流感病毒分离株的HA基因与我区2009年分离株位于不同的系统发育树分支中，而HA基因也位于不同的分支中，与WHO新推荐的流感疫苗株也不属于系统进化树同一分支，提示我区新甲型H1N1流感病毒可能存在变异，新推荐的流感疫苗可能对我区新甲型H1N1流感流行没有较好的保护作用。而季节性H3N2流感病毒分离株则与疫苗株位于同一分支，提示对我区流感流行具有较好的保护作用。

4.内蒙古自治区2018年度流感病毒对于神经氨酸酶抑制剂药物呈现出高度的敏感性，但仍需加强耐药检测。

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在学校、托幼机构、养老院等人群聚集的场所易发生聚集性疫情或暴发[3]；
婴幼儿、老人及慢性病人感染流感病毒可致住院甚至死亡；
世界上每年因流感而导致的危重病例约300万至500万，死亡约25万到50万人[5]。有研究表明流感可明显增加婴幼儿和少年儿童的门诊就医次数[4]，所以每次流感流行后，都会造成不同程度的超额死亡和巨大的经济损失[5]，提示流感监测的必要性。

传染病监测对于疾病的防控发挥着不可替代的作用。为了更好地做好流感的 预防和控制，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)于1952年成立 了全球流感监测网络(The Global Influenza Surveillance Network)，开创了传染病的全球性同步监测的先例。流感监测网络建立之初，覆盖全球80多个国家。目前全球流感监测网络己扩大为全球流感监测和报告系统(The Global Influenza Surveillance and Response System)，覆盖的国家数已达113个[6]。监测系统中的四个WHO基础管理实验室分别位于美国、日本、英国以及澳大利亚。WHO流感合作中心通过各个国家的流感监测中心收集世界各地的流感发病信息及流行毒株，并汇总和分析，根据分析结果制定全球流感防控政策[7]。流感样病例监测资料已被证实能够有效地反映流感病毒的活动和变化规律。中国于1957年成立国家流感中心，并于2009年被世界卫生组织评为第五个WHO流感合作中心。目前我国已经建成了相对较完整的覆盖全国31个省的流感监测网络，为中国的流感监测提供了强有力的技术平台[8]。

流感具有传染性强，传播速度快的特点，且抗原突变的频率高、幅度大，人 类对突变株普遍易感，因此造成其易在人群中广泛传播。据统计，每年约有5%的成人和 20%的儿童遭受流感病毒的侵袭，约有 25～50 万人死于流感相关的疾 病[9]。仅20世纪人类历史上就发生过四次流感大流行，包括 1918 年由 H1N1 流感病毒引发的“西班牙大流感”、1957年在我国贵州暴发的由 H2N2 流感病毒引起的“亚洲流感”、1968年H3N2流感病毒造成的“香港流感”以及1977年重现于我国辽宁的 H1N1 流感病毒引起的“俄罗斯流感”[10]，均对人类的身体健康和生命安全造成了极大的危害。尽管人类在对抗流感的战役中做出了巨大的努力，但仍无法断绝流感的流行和暴发。2009年甲流的暴发又一次给全球带来了巨大的灾难。

流感病毒快速的变异和难以预期的进化动态可能导致疫苗株与新的流行株失匹配，也可能出现对抗病毒药不敏感的耐药株，甚至会出现一些严重的致死性病例，这也是流感病毒成为高发病率和高病死率传染病的原因之一。可见，流感的防控对人类是个巨大的挑战。20世纪多次流感大流行的首发地均为中国[11]，因此我国成为世界公认的流感多发地和发源地，故有“中国南方是世界流感流行中心”的假说。尽管尚无明确的原因来解释这一现象，但说明了我国的流感动态受到世界卫生组织和全球各国的广泛关注。预防流感发生与传播的最佳方法是接种流感疫苗，然而由于流感病毒具有较高的变异性，使得流感疫苗对人群的有效保护时间较短，每年WHO都要根据流感病毒流行情况来预测下一年的流感流行，并提供疫苗参考株来制备相应的新疫苗[12]。

流感的活动具有明显的季节性[13]，处于北半球的美国、加拿大、欧洲等国家或地区的流感活动就具有典型的冬季高峰[14]。我国幅员辽阔，气候条件复杂，流感活动的季节性也随地域的不同而各不相同，总体来讲，北方省份流感主要发生在冬春季，南方省份流感四季都有病例发生，发病高峰在夏季和冬季。我国流感的活动存在一定的周期性，但周期规律随地区不同而不同。流感的长期变异主要表现在抗原的转变，结果往往导致世界大流行。流感发病率在男女之间没有差异。流感样病例（ILI）年龄构成比前三位均为0～岁组，5～岁组和15～岁组(部分地区第三位为25～岁组）都以“0～5岁组”为主，所以，我国流感样病例（ILI）的高发人群为“0～5岁组”提示儿童、青少年是季节性流感的高危人群，亦是防控的重点人群[15]。从职业来看，服务行业、学生和工人发病率较高。一些抵抗力较低的或有慢性疾病的老年人感染后往往使病情加重，甚至导致死亡。流感的人群分布特征主要受人群免疫力水平及接触机会这两个因素影响[16]。

2. 流感病毒病原学研究 根据相对高度保守的核蛋白（NP）和膜蛋白（M）的抗原特性不同，流感病毒可分为甲、乙、丙三型（A、B、C 三型）[17]。甲、乙型流感病毒均含有8个RNA节段，而丙型流感病毒只含有7个RNA节段，每一个节段编码1～2个蛋白。最常见且对人类生命健康危害最大的流感病毒是甲型流感病毒，可引起具有感染性的人畜禽共患性疾病，其病毒颗粒呈多形性，多数为球状，新分离的多为丝状，直径大小为80～120nm。甲型流感病毒整个基因组长度为13588bp，1～8节段RNA的长度分别为2341bp、2341bp、2233bp、1778bp、1565bp、1413bp、1027bp和890bp，分别编码PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2共10种蛋白，前6种RNA节段各编码一种蛋白，且均为流感病毒的结构蛋白，包括糖基化结构蛋白HA和NA，以及4种非糖基化结构蛋白，而后2种 RNA节段各编码两种蛋白，分别为M1、M2、和 NS1、NS2，M蛋白为基质蛋白，NS为非结构蛋白[18]。甲型流感病毒内部的8个基因节段均以核糖核蛋白复合（RNP）即核衣壳的形式存在，包含核蛋白（NP）、三种聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）以及病毒RNA[19]。RNP呈螺旋状对称排列，直径为10nm，构成病毒颗粒的核心。病毒颗粒的中间层为基质蛋白（M1蛋白），有助于病毒的装配。最外层为脂质双层的包膜，包膜上是由血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白（M2）三种糖蛋白构成的放射状突起[20]。

乙型流感病毒主要感染人并且其致病力低，一般只引起局部流行，故其危害性较小，而丙型流感病毒主要感染对象为婴幼儿，或只引起人类较轻的上呼吸道症状，很少导致流行的发生[21]。根据宿主类型的不同，流感病毒可以分为人流感病毒、猪流感病毒、禽流感病毒和马流感病毒等类型。通常情况下，流感病毒具有宿主特异性，基本上A型（甲型）流感病毒的任何亚型都能感染鸟类，但能以人为宿主的主要是H1、H2和H3亚型。H5N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2 等禽流感病毒偶尔也可以感染人，但无持续的人与人之间的传播[22]。不同亚型对不同宿主的感染能力差异较大，同一亚型不同毒株之间的感染能力也存在一定的差异。

流感病毒表面有两种具有抗原性的糖蛋白，分别为血凝素(HA)和神经胺酸酶(NA)。依据病毒表面糖蛋白HA和NA抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为 18个H亚型和11个N亚型[23]。HA是一种呈柱状的三聚体结构糖蛋白，可识别宿主细胞并与其表面多糖受体的唾液酸结合，同时可诱导机体产生保护性的抗体。NA是位于病毒颗粒表面的呈蘑菇状的四聚体结构糖蛋白，其主要功能在于防止子代病毒自身的凝聚以及促进成熟病毒粒子的释放，同时也是目前抗流感病毒药物的重要作用靶点 [24]。HA和NA的不同组合就构成了不同亚型的甲型流感病毒，也决定了流感病毒的宿主以及传染性的不同。世界性的流感大流行就是流感病毒变异与人类免疫屏障相互抗衡的结果。HA和NA的变异是流感流行的主要原因，在人群免疫压力下，常引起抗原漂移和抗原转换，前者是指基因自发产生的点突变所导致的氨基酸改变累积到一定的程度时，抗原决定簇发生改变而不产生新的亚型，属于量变，多引起中小型的流感流行；
后者是基于流感病毒不同节段的基因重组而形成新的亚型，属于质变，可引起世界大流行[25]。另外，当2个或 2个以上的流感病毒共同感染同一个宿主细胞时，可能发生基因重构，从而产生新的病毒。2009年3月在墨西哥和美国暴发的甲流病毒即由禽流感病毒（PB2、PA片段）、人流感病毒（PB1 片段）、北美经典猪流感病毒（HA、NP、NS片段）和欧亚猪流感病毒（NA、M 片段）重配的新型流感病毒，其继承了人、猪和禽类三种来源的流感病毒基因片段，毒力较其亲本猪流感病毒有所增强，引起了全球范围大规模的流行，造成了严重的疾病负担和经济损失[26]。

流感病毒的传染性强，曾引发多次人群流感大流行，而甲型流感病毒因其频繁的抗原变异成为罪魁祸首。因此，最常见且对人类生命健康危害最大的流感病毒是甲型流感病毒，其次是乙型流感病毒，丙型流感病毒较少引起流行[27]。HA用来识别宿主细胞并与其表面多糖受体的唾液酸结合，使病毒能够吸附于宿主细胞的表面，同时可诱导机体产生保护性的抗体。NA的功能在于防止子代病毒自身的凝聚以及促进成熟病毒粒子的释放。HA和NA的不同组合就构成了不同亚型的甲型流感病毒，也决定了流感病毒的宿主以及传染性的不同[28]。

甲型流感病毒的RNA突变率很高，且由于其含有多个节段，病毒复制过程中 基因易重新排列，导致流感病毒的致病性和抗原性也发生相应的变化。世界性的 流感大流行就是流感病毒变异与人类免疫屏障相互抗衡的结果[29]。

甲流病毒自2009年3月在墨西哥首次被发现后，同年5月，美国已出现642 例甲流病例，甲流迅速在全世界蔓延[30]。6月11日，WHO宣布将此次甲流大流行的警告级别提高至最高级6级,标志着21世纪第一次流感大流行的开始。2009 年至今，甲流在全球经历了6年的流行,其流行规律和变异特征也在逐渐发生变化。

流感病毒的HA可水解成HA1和HA2两个独立的肽链，二者通过二硫键相连， HA只有断裂成HA1和HA2后才具有感染性[31]。不同亚型的流感病毒的HA蛋白裂解位点的氨基酸序列不同。裂解位点碱性氨基酸的数量和附近糖基化位点的缺失等都有可能改变 HA蛋白对宿主细胞体内蛋白水解酶的敏感性，从而使得流感病毒的致病性发生改变。一般认为，HA裂解位点若仅含有单个碱性氨基酸，则表现为低致病性，若含有至少4个碱性氨基酸，则表现为高致病性的特征。如果糖基化位点上的寡糖链将含多个碱性氨基酸的HA裂解位点遮掩住，则流感毒株依旧表现为低致病性，但在复制过程中可能暴露其碱性氨基酸而转变为高致病性的毒株[32]。将2009年3月-2010年5月中国所有流行的甲流毒株的HA和NA序列与A/California/07/2009（H1N1）疫苗株对比后发现，所有中国甲流毒株的裂解位点中氨基酸序列为V 338PSIQSR↓G型，而疫苗株的则为I338PSIQSR↓G型，尽管在338位点处中国甲流毒株的氨基酸为V，不同于疫苗株的I，但其致病性并不受影响，仍表现为低致病性。

3. 流感病毒糖基化位点研究 流感病毒通过糖基化所形成的寡糖侧链对稳定流感病毒三聚体的结构及其功能具有重要的作用。一般认为，糖基化位点的改变或数目的增减会影响病毒的抗原性或对病毒的稳定性、传染性和致病性产生一定的影响。病毒在进化过程中会产生新的糖基化位点，这些糖基化位点并非病毒生存所必需的，但有可能使得抗原位点或酶催化位点被掩盖，从而使抗体对病毒颗粒的识别和中和作用降低；
也有可能影响HA蛋白的水解作用，从而阻碍蛋白酶将HA蛋白水解成HA1和HA2，影响流感病毒的致病性。Matrosovich等研究认为，HA蛋白裂解位点处糖基化 位点的增加会阻碍流感病毒识别并结合宿主细胞，糖基化位点的缺失则会增强 HA对宿主细胞蛋白酶切割的敏感性，从而使病毒的致病性增强[33]。

4. 耐药性研究 目前临床上使用二类抗流感病毒的药物，一类是干扰病毒M2 蛋白功能的药物，另一类是病毒神经氨酸酶（neuraminidase, NA）抑制剂。干扰病毒M2 蛋白功能的药物金刚烷胺和金刚乙胺曾经有效地用于预防和治疗A 型流感病毒感染，但是流行的人流感病毒逐渐对这类药物产生耐药，可能与M2蛋白第43位氨基酸发生突变，使金刚烷胺类药物无法阻断其离子通道作用，无法抑制季节性流感病毒和甲型H1N1 流感病毒的复制，目前已失去临床使用的价值[34]。

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2017年，开始攻读内蒙古科技大学包头医学院公共卫生学院公共卫生专业硕士学位。

攻读硕士学位期间发表的论文有：
1. 郭燕慧,郭卫东,跃华.内蒙古2018年流行性感冒流行病学及病原学研究[J].内蒙古医学杂志,2019,51(8):909-911.