一次性使用卫生产品杀菌性能、抑菌性能与稳定性、毒理学、微生物检测方法

　附 录 A （规范性附录）

　产品杀菌性能、抑菌性能与稳定性测试方法 A.1 样品采集 于同一批号3个运输包装中至少抽取6件最小销售包装样品（若样品数量不能满足实验所需，则应相应增加采样数量），其中1/3样品用于抑菌、抗菌或杀菌性能测试，2/3样品用于留样；如需做稳定性测试，样品数量再作相应增加。

　A.2 试验方法选择原则 A.2.1 卫生湿巾类产品选择杀菌性能试验。

　A.2.2 液体抗菌产品选择杀菌性能试验，含有可溶性抗菌成分的纺织品选择浸渍抗菌试验。含有不可溶抗菌成分的纺织品、无纺布、纤维等，经鉴别不含可溶性抗菌成分后，采用烧瓶振荡试验。

　A.2.3 液体抑菌产品选择抑菌性能试验，湿巾类或其他自身含有抑菌成分的产品选择载体抑菌试验，含有溶出性抑菌成分的产品选择抑菌环试验，含有可溶性抑菌成分的纺织品选择浸渍抑菌试验，含高吸水材料的产品选择高吸水材料抑菌性能试验。

　A.3 试验材料 A.3.1 试验菌 A.3.1.1 试验菌种类 细菌：大肠杆菌(8099或CICC 10899）或大肠杆菌（ATCC 25922）， 金黄色葡萄球菌(ATCC 6538 或 ATCC 25923)； 真菌：白色念珠菌(ATCC 10231)； 根据产品特定用途所需用的其他菌株。

　A.3.1.2 试验菌悬液制备 取冷冻条件下保存的菌种（冻干管、甘油管或磁珠），在无菌操作下打开，加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL～10.0mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，36℃±1℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平皿上，36℃±1℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，36℃±1℃培养18h～24h即为第3代培养物。取菌株第3代～6代的营养琼脂培养基（真菌为沙堡弱琼脂培养基）新鲜斜面培养物（18h～24h），用5mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液（简称PBS）洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用PBS稀释至所需浓度（浸渍抑菌实验使用肉汤对培养液进行稀释）。

　A.3.2 试验器材

　A.3.2.1 培养基：细菌培养用营养琼脂培养基，真菌培养用沙堡弱琼脂培养基；营养肉汤培养基，沙堡弱液体培养基。

　A.3.2.2 稀释液：0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2。

　A.3.2.3 中和剂（PBS配制）。

　A.3.2.4 载体：脱脂白平纹布片（长*宽：20 mm×30 mm），经压力蒸汽灭菌烤干后使用。

　A.3.2.5 计时器。

　A.3.2.6 电子天平。

　A.3.2.7 振荡摇床。

　A.3.2.8 2000r/min涡旋震荡器。

　A.3.2.9 恒温水浴箱。

　A.3.2.10 36℃培养箱。

　A.3.2.11 37℃、35℃～40℃、40℃～45℃和54℃恒温箱 A.3.2.12 Ⅱ级生物安全柜。

　A.4 卫生湿巾杀菌性能试验 A.4.1 适用范围 适用于添加有杀菌剂的卫生湿巾或可溶性抗菌物质的载体类产品的抗菌性能效果的鉴定。

　A.4.2 中和剂鉴定试验 A.4.2.1 试验菌种：根据产品有效成分，选择对其敏感度较高的细菌和白色念珠菌；当用其他特定微生物进行杀菌试验时，应以该特定微生物进行中和剂鉴定试验。

　A.4.2.2 中和剂试验分组：

　第1组：5mL中和剂+染菌对照片； 第2组：（样片+5mL中和剂）+染菌对照片； 第3组：5mL PBS+染菌对照片； 第4组：同批次PBS 0.5mL＋中和剂0.5mL＋培养基。

　A.4.2.3 中和剂试验评价规定：

　a) 第 1 组、第 2 组和第 3 组有相似量试验菌生长，并在 1.0×104 CFU/片～5.0×10 4 CFU/片之间，其组间菌落数误差率应不超过 15%； b) 第 4 组无菌生长； c) 连续 3 次试验均符合 a）和 b）要求判定为合格。

　A.4.3 试验步骤 对照样片应与试验样片同等材质、同等大小但不含杀菌成分，且经灭菌处理；将100μL试验菌悬液滴于对照样片上，回收菌数应为1.0×104 CFU/片～5.0×10 4 CFU/片。

　取试验样片（大小20 mm 30 mm，厚度应确保菌悬液被完全吸收不渗漏，如被测试样品厚度无法满足要求，可增加片数）和对照样片各1片分别置于无菌平皿内，用新鲜制备的菌悬液分别在每个试验样片与对照样片上滴加100µL，均匀涂布，开始计时，作用至说明书规定时间，用无菌镊子分别将试验样片和对照样片放入5mL相应中和剂的试管内，充分混匀，进行10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸取1.0mL接种平皿，每管接种2个平皿，将冷至40℃～

　45℃的熔化营养琼脂培养（细菌）或沙堡弱琼脂培养基（真菌），倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15mL～20mL，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，36℃±1℃培养48h（细菌）或72h（真菌），进行活菌菌落计数。

　试验3次，计算杀菌率。

　A.4.4 计算公式 杀菌率计算见式（D.1）：

　% 100cs cNN NK

　................................. (D.1) 式中：

　K ——杀菌率（%）； Nc——对照样片平均菌落数，单位为每片菌落形成单位（CFU/片）； Ns——被试样片平均菌落数，单位为每片菌落形成单位（CFU/片）。

　误差率计算见式（D.2）：

　% 1003mmnXX XE

　............................... (D.2) 式中：

　E ——组间菌落数误差率（%）； Xm——三组间菌落平均数，单位为每皿菌落形成单位（CFU/皿）； Xn ——各组菌落平均数，单位为每皿菌落形成单位（CFU/皿）。

　A.4.5 评价标准 各次杀菌率均≥90%，产品有杀菌作用。

　卫生湿巾的最长杀菌作用时间不应超过5min。

　A.5 产品抗菌性能试验 A.5.1 抗菌剂杀菌性能试验 A.5.1.1 适用范围 适用于液体抗菌剂或卫生湿巾挤出液对微生物抗菌效果的测定。

　A.5.1.2 中和剂鉴定试验 A.5.1.2.1 试验菌种：根据产品有效成分，选择对其敏感度较高的细菌和白色念珠菌；当用其他特定微生物进行杀菌试验时，应以该特定微生物进行中和剂鉴定试验。

　A.5.1.2.2 中和剂试验分组：

　第1组：4.5mL中和剂+0.45mL硬水+0.05mL菌悬液；

　 第2组：（0.45mL样液+4.5mL中和剂）+0.05mL菌悬液； 第3组：4.95mLPBS +0.05mL菌悬液； 第4组：同批次PBS0.5mL＋中和剂0.5mL＋培养基。

　A.5.1.2.3 中和剂试验评价规定：

　a) 第 1、2、3 组有相似量试验菌生长，并在 1.0×104

　CFU/mL～5.0×10 4

　CFU/mL 之间，其组间菌落数误差率（计算见式 D.2）应不超过 15%； b) 第 4 组无菌生长； c) 连续 3 次试验均符合 a）和 b）要求判定为合格。

　A.5.1.3 试验步骤 取新鲜制备的菌悬液0.5mL滴加于4.5mL样液内，混匀后开始计时，作用至说明书规定时间，用定量吸管吸取菌药混悬液0.5mL放入4.5mL含有中和剂的试管内，充分混匀，进行10倍系列稀释，选择适宜稀释度，分别吸取1.0mL接种平皿，每管接种2个平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养（细菌）或沙堡弱琼脂培养基（真菌），倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15mL～20mL，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，36℃±1℃培养48h（细菌）或72h（真菌），进行活菌菌落计数。试验同时用稀释液代替试样，进行平行试验，作为阳性对照，回收菌数为1.0×104 CFU/mL～5.0×10 4 CFU/mL。

　试验3次，计算杀菌率。

　A.5.1.4 计算公式 杀菌率计算见式（D.3）：

　% 100cs cNN NK

　................................. (D.3) 式中：

　K ——杀菌率（%）； Nc——对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Ns——被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。

　A.5.1.5 评价标准 说明书规定时间的各次杀菌率均≥90%，判有抗菌作用；说明书规定时间的各次杀菌率均≥99%，判有较强抗菌作用。

　抗菌剂的最长杀菌作用时间不应超过5min。

　A.5.2 载体浸泡定量杀菌试验 A.5.2.1 适用范围 适用于粘稠状（半固体）抗菌产品如抗菌洗手液、抗菌沐浴露、抗菌凝胶、膏状抗菌产品等对微生物抗菌效果的鉴定。

　A.5.2.2 染菌载体制备

　取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约5.0×106

　CFU/mL～5.0×10 7

　CFU/mL制成菌悬液备用。用微量移液器滴染10μL菌悬液于灭菌载体上，35℃±1℃烘干或室温晾干备用。

　A.5.2.3 中和剂鉴定试验

　A.5.2.3.1 试验分组 第1组：5.0 mL中和剂 + 染菌载体 → 培养 第2组：（含抗菌剂的载体 + 5.0 mL中和剂）+ 染菌载体→ 培养

　第3组：5.0 mL稀释液 + 染菌载体→ 培养 第4组：稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养 A.5.2.3.2 试验步骤 根据试验分组，准备试管和平皿，依次进行编号。

　第1组：取5.0 mL中和剂于无菌平皿中，置20℃±1℃水浴5min，加入1片染菌载体，作用10min，取出菌片放入5.0 mL中和剂试管内，作用10min后，置涡旋振荡器上振荡1min或在手掌上用力振打80次，将试验菌洗下，用中和剂做10倍系列稀释后，选择适宜稀释度，分别吸取1.0 mL接种于2个平皿中，做活菌培养计数。

　第2组：取5.0 mL中和剂于无菌平皿内，加入1片沾有抗菌样品的载体，混匀，置20℃±1℃水浴作用10min制成中和产物。再用无菌镊子取1片染菌载体，浸于中和产物中作用10min后，用无菌镊子取出染菌载体移入含5.0 mL中和产物试管中，作用10min，振荡，将试验菌洗下，用中和产物做10倍系列稀释,选适宜稀释度分别吸取1.0 mL接种于2个平皿中，做活菌培养计数。

　第3组：取5.0 ml PBS于无菌平皿中，置20℃±1℃水浴5min，加入1片染菌载体，作用10min，取出菌片放入5.0 mL PBS试管内，作用10min后，振荡，将试验菌洗下，用PBS做10倍系列稀释, 选适宜稀释度分别吸取1.0 mL接种于2个平皿中，做活菌培养计数。

　第4组：分别吸取稀释液（PBS）与中和剂各1.0 mL于同一无菌平皿内，倒入同批次的培养基15～20 mL，培养观察。

　A.5.2.3.3 结果判定 第1、2和3组有相似量试验菌生长，且菌量在1.0×104

　CFU/片～9.0×10 4

　CFU/片。计算组间菌落数误差率（计算见式D.2），其组间菌落数误差率应不超过15%。第4组无菌生长，否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。试验3次，每次试验均应符合以上要求。

　A.5.2.4 试验步骤

　按5 g/片的量称取抗菌样品于无菌平皿内，置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取染菌载体，使载体完全浸没于抗菌样品中，立即计时。

　待染菌载体与抗菌剂相互作用至各预定时间（以说明书规定时间为T，时间分别为0.5T，T，1.5T），分别取染菌载体加入5.0 mL中和剂试管中，混匀。

　经中和剂作用10min后，振荡，将试验菌洗下，分别吸取1.0 mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用PBS进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

　取与试验样品同质材料不含抗菌成分的对照样品代替抗菌样品浸泡2片染菌载体，进行平行试验， 作为阳性对照。阳性对照回收菌量为1.0×104

　CFU/片～9.0×10 4

　CFU/片。取同批次稀释液、中和剂、培养基作阴性对照。

　所有试验样品和对照样品均在36℃±1℃培养，细菌繁殖体培养48h观察结果；白色念珠菌培养72h 观察结果。试验3次，计算杀菌率。

　A.5.2.5 杀菌率计算

　杀菌率计算见式（D.4）：

　% 100cs cNN NK

　................................. (D.4)

　式中：

　K ——杀菌率（%）； Nc——对照样品平均菌落数，单位为每片菌落形成单位（CFU/片）； Ns——被试样品平均菌落数，单位为每片菌落形成单位（CFU/片）。

　A.5.2.6 评价标准 说明书规定时间的杀菌率≥90%，判有抗菌作用；说明书规定时间的杀菌率≥99%，判有较强抗菌作用。

　A.5.3 浸渍杀菌试验 A.5.3.1 适用范围 适用于抗菌毛巾、抗菌棉袜、抗菌棉布等含有溶出性抗菌材料的抗菌织物对微生物抗菌效果的试验。

　A.5.3.2 试剂、培养基及器材 A.5.3.2.1 试样 在距试样布边10 cm以上、离布端1 m以上部位，剪取直径为5 cm的圆形试样若干，取3份试样分别装于3个锥形瓶中，盖好瓶口备用（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1 mL菌悬液且锥形瓶中不留残液为度）。另同法剪取与试样相同材质但不含抑菌剂对照织物若干，取2份分别装于2个锥形瓶中，盖好瓶口，121℃灭菌15min备用。

　A.5.3.2.2 菌悬液的制备 用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平皿，36℃±1℃培养18h～24h，取典型的菌落移种到含肉汤培养基的锥形瓶中，36℃±1℃培养24 h，用肉汤对培养液进行系列稀释，使菌悬液的含菌量为1.0×105

　CFU/mL～5.0×10 5

　CFU/mL。

　A.5.3.3 试验步骤 分别取1 mL菌悬液加入2份准备好的锥形瓶内试样和1份对照织物上，确保其均匀分布，且锥形瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸发，造成细菌死亡。

　分别在一个盛有已接种菌悬液的试样和对照织物的锥形瓶中加入100 mL中和剂，置涡旋振荡器上振荡1min洗涤细菌，取1.0 mL进行10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为“0”接触时间样品和对照织物上的细菌数。

　将另一个装有已接种菌悬液试样的锥形瓶于36℃±1℃培养20h±2h，加入100 mL中和剂，置涡旋振荡器上振荡1min洗涤细菌，取1.0 mL进行10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为试验组。

　阴性对照组：试样不接种菌悬液，在“0”接触时间加入100 mL中和剂，置涡旋振荡器上振荡1min 取样，接种平皿。

　阳性对照组：另取1个装有对照织物的锥形烧瓶，接种1 mL菌悬液后，在36℃±1℃培养20 h±2 h， 加入100 mL PBS，置涡旋振荡器上振荡1min洗涤细菌，取1.0 mL进行10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿。

　将阴性和阳性对照样品与试验组样品接种的平皿一并于36℃±1℃培养48h，计数菌落数。试验3次。

　产品对白色念珠菌等其他微生物抗菌效果的测试方法同上，选择相应的菌株。

　A.5.3.4 杀菌率的计算

　杀菌率计算见式（D.5）：

　       % 1002 c t c ts - 2 c t c tN N N NN N N N NK或 或或 或 ........................ (D.5) 式中：

　K ——杀菌率（%）； Ns——被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Nt——“0”接触时间被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Nc——“0”接触时间对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； 如果Nt和Nc差别较大时，取较大值；如果Nt和Nc差别不大时，取平均值。

　A.5.3.5 评价标准 A.5.3.5.1 “0”接触时间对照织物的平均菌落数应在1.0×103

　CFU/mL～5.0×10 3

　CFU/mL。

　A.5.3.5.2 阴性对照应无菌生长，阳性对照菌数比“0”接触时间的菌数明显增加。

　A.5.3.5.3 各次试验的杀菌率均≥90%，即可认定该样品具有抗菌作用；各次杀菌率均≥99%，判有较强抗菌作用。

　A.5.4 振荡烧瓶试验 A.5.4.1 适用范围 适用于对含非溶出性抗菌物质抗菌产品的抗菌性能检测。

　注1：在进行振荡烧瓶试验前，需要鉴定其抗菌成分是否可溶出，如果有溶出性抗菌材料，参照可溶出抗菌材料检测，无溶出性抗菌材料，可选用振荡烧瓶法进行。

　注2：非溶出性抗菌材料的鉴定：将样品置于无菌蒸馏水浸泡24h，取浸泡液参照抗菌剂杀菌性能试验检验是否有抗菌效果。如果无抗菌效果，说明样品属非溶出性抗菌材料，进行振荡烧瓶试验。

　A.5.4.2 试验步骤 A.5.4.2.1 将材料剪切成10mm×10mm样片，称取0.75g两份分别置入250mL的锥形烧瓶中。

　A.5.4.2.2 在上述锥形烧瓶中加入70mL PBS和5mL新鲜制备的菌悬液，使菌悬液在PBS中的浓度为 1.0×104

　CFU/mL～5.0×10 4

　CFU/mL。

　A.5.4.2.3 将锥形烧瓶固定于振荡摇床上，在20℃～25℃条件下，以300r/min振摇2min，吸取1.0mL作为试验组振荡前样液；继续振摇至1h，吸取1.0mL样液作为试验组振荡后样液。

　A.5.4.2.4 用PBS对振荡前和振荡后样液进行适当稀释后，每个平皿加样液1.0 mL，以琼脂倾注法接种平皿，每个样液分别接种两个平皿，培养后进行活菌菌落计数。

　A.5.4.2.5 同时设阴性对照样片组和不加样片组。阴性对照样片组的对照样片应与试验样片同等材质、同等大小但不含抑菌成分，且经灭菌处理；不加样片组分别取5mL菌悬液和70mL PBS 加入250mL三角烧瓶中，混匀，分别于振荡前和振荡后预定时间，各取1.0mL菌悬液与PBS的混合液进行适当稀释，进行活菌菌落计数。

　A.5.4.2.6 以试验同批次的稀释液、培养基分别设阴性对照。

　A.5.4.2.7 试验3次。

　A.5.4.3 计算公式 杀菌率见计算见式（D.6）：

　 % 100cs cNN NK

　................................. (D.6) 式中：

　K ——杀菌率（%）； Nc——样品振荡前平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Ns——样品振荡后平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。

　A.5.4.4 评价标准 A.5.4.4.1 各次试验阴性对照均应无菌生长。

　A.5.4.4.2 不加样片组活菌计数在1.0×104

　CFU/mL～5.0×10 4

　CFU/mL之间，且样品振荡前后平均菌落数差值在10% 以内，试验有效。

　A.5.4.4.3 各次试验中，试验样片杀菌率与对照样片杀菌率的差值＞26%，产品具有抗菌作用。

　A.5.4.4.4 抗菌纤维类产品的最长抗菌作用时间不应超过1h。

　A.5.4.5 注意事项 A.5.4.5.1 振荡前应将振荡摇床上的锥形瓶固定牢，以免碰破。

　A.5.4.5.2 试验中，在实验误差允许的范围内，如果试验样片和对照样片出现振荡后菌落数高于振荡前菌落数的情况，其杀菌率可按“0”计算。

　A.6 产品抑菌性能试验 A.6.1 抑菌剂抑菌性能试验 A.6.1.1 适用范围 适用于液体抑菌剂对微生物抑菌效果的测定。

　A.6.1.2 试验步骤 取新鲜制备的菌悬液0.5mL滴加于4.5mL样液内，混匀后开始计时，作用至预定时间，用定量吸管吸取菌药混悬液0.5mL放入4.5mL稀释液的试管内，充分混匀，分别吸取1.0mL接种平皿，每管接种2个平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养（细菌）或沙堡弱琼脂培养基（真菌），倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15mL～20mL，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，36℃±1℃培养48h（细菌）或72h（真菌），进行活菌菌落计数。试验同时用稀释液代替试样，进行平行试验，作为阳性对照，回收菌数为1.0×104

　CFU/mL～5.0×104

　CFU/mL。

　试验3次，计算抑菌率。

　A.6.1.3 计算公式 抑菌率计算见式（D.7）：

　% 100cs cNN NY

　................................. (D.7) 式中：

　Y ——抑菌率（%）； Nc——对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）；

　Ns——被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。

　A.6.1.4 评价标准 各次抑菌率均为50%～90%，产品有抑菌作用；各次抑菌率均＞90%，产品有较强抑菌作用。

　抑菌剂的最长抑菌作用时间不应超过5min。

　A.6.1.5 注意事项 若由原液接种的平皿上菌落数＞300 CFU或难以计数时，才需进行10倍系列稀释，选择适宜稀释度平皿作活菌菌落计数。

　A.6.2 载体浸泡定量抑菌试验 A.6.2.1 适用范围 适用于膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌产品对微生物抑菌效果的测定。

　A.6.2.2 试验步骤

　取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约5.0×106

　CFU/mL～5.0×10 7

　CFU/mL制成菌悬液备用。用微量移液器滴染10μL菌悬液于灭菌载体上，35℃±1℃烘干或室温晾干备用。

　按5 g/片的量称取样品于无菌平皿内，置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取染菌载体，使载体完全浸没于样品中，立即计时。待染菌载体与样品相互作用至说明书的规定时间，分别取染菌载体加入5.0 mL PBS试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，分别吸取1.0 mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数， 每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用PBS进行10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。取10.0g与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样品浸泡2片染菌载体进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌量为1.0×104

　CFU/片～9.0×10 4

　CFU/片。取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样品和对照样品接种平皿均在36℃±1℃培养，细菌繁殖体培养48h观察结果；白色念珠菌培养72h观察结果。试验3次，计算抑菌率。

　A.6.2.3 计算公式 抑菌率计算见式（D.8）：

　% 100cs cNN NY

　................................. (D.8) 式中：

　Y ——抑菌率（%）； Nc——对照样品平均菌落数，单位为每片菌落形成单位（CFU/片）； Ns——试验样品平均菌落数，单位为每片菌落形成单位（CFU/片）。

　A.6.2.4 评价标准 抑菌率为50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有较强抑菌作用。

　A.6.3 抑菌环试验 A.6.3.1 适用范围

　适用于含溶出性抑菌物质，或可制成直径为5 mm片状物的固体抑菌产品的抑菌效果鉴定；也可用于鉴别抑菌产品中是否含有可溶性抑菌物质。

　A.6.3.2 试剂、培养基及器材 A.6.3.2.1 液体材料试验载体：5mm直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120℃烤干2h，保存备用。

　A.6.3.2.2 微量移液器：5μL～50μL，可调式。

　A.6.3.2.3 游标卡尺。

　A.6.3.3 操作步骤 A.6.3.3.1 试验样片的制备：对液体材料，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加产品实际使用浓度的溶液5μL，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置37℃恒温箱中烤干，或置室温下自然干燥后备用。对固体材料，可直接制成直径为5mm、厚度不超过4mm的圆片（块），每4片（块）一组。

　A.6.3.3.2 阴性对照样片的制备：对液体材料，取无菌干燥滤纸片,每片滴加无菌蒸馏水5μL，干燥后备用。对固体材料，对照样片应与试验样片同等材质、同等大小但不含抑菌成分。

　A.6.3.3.3 试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105

　CFU/mL～5×10 6

　CFU/mL新鲜制备的试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°,最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。

　A.6.3.3.4 样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板,每个平板贴放4 片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，阴性对照样片贴于平板中心位置，试验样片贴于四周。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置36℃±1℃培养箱，培养16h～18h测量结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。试验3次（共12个样片）。

　测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。

　A.6.3.4 评价标准 A.6.3.4.1 抑菌作用的判断：抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用。

　A.6.3.4.2 试验3次（共12个样片）均有抑菌作用结果者，判为有抑菌作用。

　A.6.3.4.3 阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。

　A.6.3.5 注意事项 A.6.3.5.1 每次试验均应设置阴性对照，不可省略，在报告中亦应将对照组的结果列出。

　A.6.3.5.2 接种用细菌悬液的浓度应符合要求。

　A.6.3.5.3 应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。

　A.6.3.5.4 培养时间不得超过18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。

　A.6.3.5.5 抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。

　A.6.4 浸渍抑菌试验 A.6.4.1 适用范围

　适用于溶出性抑菌织物（如抑菌毛巾、内衣等）抑菌效果的测定。

　A.6.4.2 试剂、培养基及器材 A.6.4.2.1 试样 在距试样布边10 cm以上、离布端1 m以上部位，剪取直径为5 cm的圆形试样若干，取3份试样分别装于3个锥形瓶中，盖好瓶口备用（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1 mL菌悬液且锥形瓶中不留残液为度）。另同法剪取与试样相同材质但不含抑菌剂对照织物若干，取2份分别装于2个锥形瓶中，盖好瓶口，121℃灭菌15min备用。

　A.6.4.2.2 菌悬液的制备 用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平皿，36℃±1℃培养18h～24h，取典型的菌落移种到含肉汤培养基的锥形瓶中，36℃±1℃培养24 h，用肉汤对培养液进行系列稀释，使菌悬液的含菌量为1.0×105

　CFU/mL～5.0×10 5

　CFU/mL。

　A.6.4.3 试验步骤 分别取1 mL菌悬液加入2份准备好的锥形瓶内试样和1份对照织物上，确保其均匀分布，且锥形瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸发造成细菌死亡。分别在一个盛有已接种菌悬液的试样和对照织物的锥形瓶中加入100 mL PBS，置涡旋振荡器上振荡1min洗涤细菌，分别吸取1.0 mL样液或10倍系列稀释液接种2个平皿，作为“0”接触时间样本和对照织物上的细菌数。

　将另一个装有已接种菌悬液试样的锥形瓶于36℃±1℃培养20h±2h，加入100 mL PBS，置涡旋振荡器上振荡1min洗涤细菌，分别吸取1.0 mL样液或10倍系列稀释液接种2个平皿，作为试验组。

　阴性对照组，试样不接种菌悬液，在“0”接触时间加入100 mL PBS，置涡旋振荡器上振荡1min取样， 接种平皿。

　阳性对照组，另取1个装有对照织物的锥形烧瓶，接种1 mL菌悬液后，在36℃±1℃培养20 h±2h， 加入100 mL PBS，置涡旋振荡器上振荡1min洗涤细菌，分别吸取1.0 mL样液或10倍系列稀释液接种2个平皿。将阴性和阳性对照样品与试验组样品接种的平皿一并于36℃±1℃培养48h，计数菌落数。试验3次，计算抑菌率。

　A.6.4.4 计算抑菌率 抑菌率计算见式（D.9）：

　      % 1002 c t c ts - 2 c t c tN N N NN N N N NY或 或或 或 ........................ (D.9) 式中：

　Y ——抑菌率（%）； Ns——被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Nt——“0”接触时间被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Nc——“0”接触时间对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； 如果Nt和Nc差别较大时，取较大值；如果Nt和Nc差别不大时，取平均值。

　A.6.4.5 评价标准

　A.6.4.5.1 “0”接触时间对照织物的平均回收菌量应为1.0×103

　CFU/mL～5.0×10 3

　CFU/mL。

　A.6.4.5.2 阴性对照应无菌生长，阳性对照菌数比“0”接触时间的菌数明显增加。

　A.6.4.5.3 各次试验的抑菌率均≥50%，即可判定该样品具有抑菌作用。

　A.6.5 高吸水材料抑菌性能试验 A.6.5.1 适用范围 本试验方法适用于含有非溶出性高吸水材料抑菌产品抑菌效果的测定。

　注：在进行本试验前，需要鉴定其抑菌成分是否可溶出。

　非溶出性抑菌材料的鉴定：将样品置于无菌蒸馏水浸泡24h，取浸泡液参照抑菌剂抑菌性能试验检验是否有抑菌效果。如果无抑菌效果，说明样品属非溶出性抑菌材料，可进行高吸水材料抑菌性能试验。

　A.6.5.2 试剂、培养基及器材 将10cm×30cm大小的食品级尼龙布（250目）用封口机做成10cm×15cm的尼龙布袋，作为测定吸液量备用。

　测试样品选取产品的抑菌层。对照样品应与测试样品选自相同部位，同等材质、同等大小但不含抑菌成分。

　A.6.5.3 吸液量的测定 取测试样品和对照样品分别剪成5mm×5mm的大小，各称重1.0±0.01g，分别放入预制的尼龙布袋中。分别将含有测试样品、对照样品的尼龙布袋以及不含样品的空尼龙布袋称重后放入肉汤培养液中，浸泡30min（注意去除气泡）后，吊起尼龙布袋20min后分别称重。测试样品、对照样品以及空的尼龙布袋分别测定三次吸液量取平均值。

　图 D.1

　吸液量测定步骤 吸液量计算见式（D.10）及（D.11）：

　 j j jB M S m -  

　................................. (D.10)

　33 2 1S S SV 

　.................................. (D.11) 式中：

　S j

　——各个样品所吸收的肉汤培养液重量，单位为克（g）；

　M j

　——吸收后的含有吸水样品的尼龙布袋的重量，单位为克（g）； m j

　——吸收前样品的重量，单位为克（g）； B

　——吸收后尼龙布袋的重量，单位为克（g）； V

　——样品平均吸液量，单位为克（g）。

　A.6.5.4 试验步骤 菌悬液制备过程：用5mL肉汤洗下菌苔，使菌悬浮均匀后使用肉汤稀释至所需浓度（1.0×103

　CFU/mL～1.0×10 4

　CFU/mL）。

　取测试和对照样品0.2±0.002g分别放入玻璃试管中，根据D.6.5.3算出的测试和对照样品的吸液量进行换算，分别向测试及对照样品中轻轻地滴入相应的菌悬液（1.0×103

　CFU/mL～1.0×104

　CFU/mL）（接种菌悬液不应接触到玻璃试管壁）。静置15min让样品充分吸收菌悬液后，轻轻地盖上试管盖（请勿振荡），36℃±1℃培养24h。培养后的对照样、测试样以及“0”培养时间的对照样和测试样中，分别加入相应吸液量2倍的含2%吐温80的0.85%生理盐水，分别充分震荡后（在振荡器上振荡5次，每次5秒），进行10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸取1.0mL接种平皿，每管接种2个平皿，每皿用凉至40℃～45℃的营养琼脂培养基（细菌）或沙堡弱琼脂培养基（真菌）15mL～20mL做倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，36℃±1℃培养48h（细菌）或72h（真菌），进行活菌菌落计数。试验3次，计算抑菌活性值。

　 图 D.2 抑菌性能试验步骤 A.6.5.5 试验成立条件 测试样和对照样样品吸液量组内、组间误差（计算参见式D.2）要求均在15%以内。

　对照样“0”时回收菌量不少于1.0×103 ～1.0×10 4 CFU/mL,且24h的回收菌量比“0”时增加2lg以上。

　A.6.5.6 计算公式 抑菌活性值计算见式（D.12）：

　     S C S CN N N N N N R lg lg lg0 0  

　...................... (D.12) 式中：

　R ——抑菌活性值； Ns——接触24 h后被试样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； Nc——接触24 h后对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； N 0 ——“0”时接种后对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。

　A.6.5.7 评价标准 各次试验抑菌率活性值均≥2判断有抑菌作用。

　A.6.5.8 注意事项 吸取回收液接种培养时，如混入吸水材料可能会影响试验结果，应重新进行试验。

　A.7 稳定性测试方法 A.7.1 测试条件 A.7.1.1 室温留样：将原包装样品置25℃±1℃下按产品使用说明规定的时间抽样进行抑菌、抗菌或杀菌性能测试。

　A.7.1.2 加速试验（微生物法）：将原包装样品置54℃±1℃恒温箱内14d或37℃±1℃恒温箱内90d或40℃～45℃恒温箱内180d或35℃～40℃恒温箱内270d，保持相对湿度75%±5%，抽样进行抑菌、抗菌或杀菌性能测试。

　A.7.1.3 加速试验（化学测定法）：将原包装样品置54℃±1℃恒温箱内14d或37℃±1℃恒温箱内90d或40℃～45℃恒温箱内180d或35℃～40℃恒温箱内270d，保持相对湿度75%±5%，于放置前、后分别测定抑菌、抗菌或杀菌有效成分含量。

　A.7.2 评价标准 A.7.2.1 自然留样：其抑菌率或杀菌率达到规定的标准值，产品的抑菌、抗菌或杀菌作用有效期为自然留样时间。

　A.7.2.2 加速试验（微生物法）：经54℃加速试验，其抑菌率或杀菌率达到规定的标准值，产品的抑菌、抗菌或杀菌作用有效期室温条件下为1年。经37℃加速试验，其抑菌率或杀菌率达到规定的标准值，产品的抑菌、抗菌或杀菌作用有效期室温条件下为2年。若经40℃～45℃存放180d或35℃～40℃存放270d，其抑菌率或杀菌率达到规定的标准值，产品的抑菌、抗菌或杀菌作用有效期室温条件下为3年。

　A.7.2.3 加速试验（化学测定法）：经54℃存放14d，有效成分下降率小于10%，且存放后有效成分含量均不低于产品企业标准规定含量的下限值，则贮存有效期可定为1年。若经37℃存放90d，有效成分下降率小于10%，且存放后有效成分含量均不低于产品企业标准规定含量的下限值，则贮存有效期可定为2年。若经40℃～45℃存放180d或35℃～40℃存放270d，有效成分下降率小于10%，且存放后有效成分含量均不低于产品企业标准规定含量的下限值，则贮存有效期可定为3年。

　A.7.2.4 当加速试验抑菌率或杀菌率结果与化学测定法结果不一致时，以抑菌率或杀菌率结果作为判定依据。

　附 录 B （规范性附录）

　产品毒理学试验方法 B.1 试验方法 皮肤刺激试验、阴道黏膜刺激试验和皮肤变态反应试验方法按GB/T 38496中相应的试验方法进行。

　固体产品的样品制备方法按照E.2进行。

　注1：用于皮肤刺激试验中的空白对照应为：生理盐水和斑贴纸。

　注2：在皮肤变态反应中，致敏处理和激发处理所用的剂量保持一致。

　B.2 样品制备 B.2.1 皮肤刺激试验和皮肤变态反应试验 以横断方式剪一块斑贴大小（2.5cm×2.5cm）的产品。对于干的产品，如尿布、妇女经期卫生用品，用生理盐水润湿后贴到皮肤上，再用斑贴纸覆盖。湿的产品，如湿巾，则可以按要求裁剪合适的面积，直接贴到皮肤上，再用斑贴纸覆盖。

　B.2.2 眼刺激试验 B.2.2.1 干性产品（如纸巾、棉柔巾）

　以横断方式剪取足够重量的产品，先测定产品的“吸收容量”，即每克产品所吸收的浸提液总量；以同样方式剪取同样重量的产品，除产品的“吸收容量”外，再按1g/10mL的比例加入灭菌生理盐水进行浸提，密封于萃取容器中搅拌后置于37℃± 1℃下24h。冷却到室温，搅拌后析取样液备检。

　B.2.2.2 湿性产品(如湿巾) 在进行眼刺激试验的当天，挤出湿巾里的添加液作为试样。

　B.2.3 阴道黏膜刺激试验 B.2.3.1 干性产品（如妇女经期卫生用品）

　以横断方式剪取足够重量的产品，先测定产品的“吸收容量”，即每克产品所吸收的浸提液总量；以同样方式剪取同样重量的产品，除产品的“吸收容量”外，再按1g/10mL的比例加入灭菌生理盐水进行浸提，密封于萃取容器中搅拌后置于37℃± 1℃下24h。冷却到室温，搅拌后析取样液备检。

　B.2.3.2 湿性产品(如卫生湿巾) 在进行阴道黏膜刺激试验的当天，挤出湿巾里的添加液作为试样。

　B.3 判定标准

　以GB/T 38496的相应部分作为试验结果判定原则。

　附 录 C （规范性附录）

　产品微生物检测方法 C.1 检验规则 企业应按每个投料批次或结合产品特点和生产实际规定的产品批次确定微生物检验批次；细菌菌落总数和真菌菌落总数检验按确定的检验批次进行；必要时进行特定微生物检验。每个检验批次在生产线至少随机抽取6个最小包装样品（采样量应至少能满足检验所需），1/3用于检验，2/3留样；必要时对库存产品进行抽检。不够数量全抽，但需要满足最低检测量的要求。

　出厂检验应按照产品执行标准或质量控制程序所规定的指标进行，确保产品合格出厂。

　当新产品定型投产，原材料、工艺、配方或设备变更影响产品主要性能时，或停产6个月以上恢复生产时，企业应进行型式检验；检验项目为全部微生物学指标。

　C.2 产品采集与样品处理 于同一批号的3个运输包装中至少抽取6件最小销售包装样品（若样品数量不能满足实验所需，则应相应增加采样数量），其中1/3样品用于检测，2/3样品用于留样。抽样的最小销售包装不应有破裂，检验前不得开启。

　在空气洁净度5级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少2个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品。剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水或改良肉汤 培养液（MLTBL，含中和剂 ）

　中，充分混匀，得到一个生理盐水或中和剂样液（若晕车贴、卫生手套、指套等产品太轻，可称取2.5g±0.2 g样品,加入50ml灭菌生理盐水或中和剂中）。液体产品吸取10mL原液直接作样液。

　如被检样品具有抗菌作用，应选择适宜的中和剂中和，稀释梯度最高不超过1:100。无相应中和剂则选用薄膜过滤法去除样品中抗菌成分对微生物生长的影响，再按上述方法制备样液。

　如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50mL递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。

　C.3 细菌菌落总数与初始污染菌检测方法 C.3.1 适用范围 本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数（以下统称为“细菌菌落总数”）检测。

　C.3.2 操作步骤 按F.2得到的生理盐水或中和剂样液自然沉降后取上清液，如需要可进行10倍系列稀释。选择适宜的稀释度进行菌落计数。共接种2个平皿，每个平皿中加入2.0mL样液，然后用冷却至40℃～45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15mL～20mL倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置36℃±1℃培养48h，计算平皿上的菌落数。

　C.3.3 菌落计数 菌落呈片状生长的平皿不宜采用，确保2块平皿符合计数要求并进行菌落计数，按式(F.1)计算结果：

　2 20K AA t

　..................................... (F.1) 式中：

　A t ——细菌菌落总数，单位为每克菌落形成单位（CFU/g）

　或每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； A 0 ——2块营养琼脂培养基平皿上的细菌菌落总数； K——稀释倍数； （2×2）——2块平皿，每块平皿接种2mL样液。

　首先选取平均菌落数在30～300之间的平皿。当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字；当2块营养琼脂培养基平皿上的细菌菌落总数＜1时，应当报告细菌菌落总数＜5 CFU/g (CFU/mL)。

　C.3.4 结果报告 C.3.4.1 如经首次检测，样品细菌菌落总数符合本标准的规定，直接按检测结果报告。

　C.3.4.2 如经首次检测，样品细菌菌落总数超过本标准的规定，应用留存的样品依前法复测2次，然后才能报告结果。当2次复测结果都达到本标准的规定，则判定被检样品合格，以2次合格结果的均值报告；其中有任何1次复测结果超过本标准规定，则判定被检样品不合格，以所有不合格结果的均值报告。

　C.4 大肠菌群检测方法 C.4.1 操作步骤 C.4.1.1 增菌培养：取样液5mL接种至50mL乳糖胆盐发酵管内，置36℃±1℃培养18h～24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。

　C.4.1.2 分离培养：如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平皿，置36℃±1℃培养18h～24h，观察平皿上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。

　C.4.1.3 染色镜检与鉴定：取疑似菌落1～2个作革兰染色镜检，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养18h～24h，观察产酸产气情况。

　C.4.2 结果报告 凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平皿上有典型大肠菌群菌落，革兰染色为阴性无芽孢杆菌，可报告被检样品检出大肠菌群。

　C.5 铜绿假单胞菌检测方法 C.5.1 操作步骤

　C.5.1.1 增菌培养：取样液5mL，加入到50mL SCDLP 培养液中，充分混匀，置36℃±1℃培养18h～24h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。

　C.5.1.2 分离培养：

　a) 从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平皿，置36℃±1℃培养 18h～24h，观察菌落特征。铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色； b) 在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌悬液划线接种于平皿上，放 36℃±1℃培养 18h～24h，观察菌落特征。铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色。

　C.5.1.3 染色镜检：取鉴定培养基上可疑菌落涂片作革兰染色，镜检为革兰阴性菌者还需进行下列试验。

　C.5.1.4 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取鉴定培养基上可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，30s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。亦可使用使用商品化的氧化酶试纸或试剂进行检测。

　C.5.1.5 绿脓菌素试验：取鉴定培养基上2～3 个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，36℃±1℃培养24h，加入三氯甲烷3mL～5mL，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。

　C.5.1.6 硝酸盐还原产气试验：取鉴定培养基上可疑菌落接种在硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养24h，培养基小倒管中有气者即为阳性。

　C.5.1.7 明胶液化试验：取鉴定培养基上可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36℃±1℃培养24h，取出放于4℃～10℃，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。

　C.5.1.8 42℃生长试验：取鉴定培养基上可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42℃培养24h～48h，有铜绿假单胞菌生长为阳性。

　C.5.2 结果报告 被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验均为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。

　C.6 金黄色葡萄球菌检测方法 C.6.1 操作步骤 C.6.1.1 增菌培养：取样液5mL，加入到50mL SCDLP 培养液中，充分混匀，置36℃±1℃培养18h～24h。

　C.6.1.2 分离培养：自上述增菌悬液中取1～2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置36℃±1℃培养24h～48h。在血琼脂平皿上典型菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird Park培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2mm～3mm,颜色呈灰色到黑色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带，用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶尔会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。

　C.6.1.3 染色镜检：挑取典型菌落，涂片作革兰染色镜检，金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，排列成葡萄状，无芽孢与荚膜。镜检符合上列情况，还需进行甘露醇发酵试验和血浆凝固酶试验。

　C.6.1.4 甘露醇发酵试验：取血琼脂平皿上典型菌落接种甘露醇培养液，置36℃±1℃培养24h，发酵甘露醇产酸者为阳性。

　C.6.1.5 血浆凝固酶试验：试管法：吸取1:4新鲜血浆0.5mL，放灭菌小试管中，加入等量待检菌24h 肉汤培养物0.5mL，混匀，放36℃±1℃温箱或水浴中，每30min观察一次，24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5mL作为阳性与阴性对照。

　C.6.2 结果报告 凡在琼脂平皿上有可疑菌落生长，镜检为革兰阳性呈葡萄状排列的球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。

　C.7 溶血性链球菌检测方法 C.7.1 操作步骤 C.7.1.1 增菌培养：取样液5mL加入到50mL葡萄糖肉汤，36℃±1℃培养18h～24h。

　C.7.1.2 分离培养：将培养物划线接种血琼脂平皿，36℃±1℃培养18h～24h观察菌落特征。溶血性链球菌在血琼脂平皿上为灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无色透明溶血圈。

　C.7.1.3 染色镜检：挑取典型菌落作涂片革兰染色镜检，应为革兰阳性，呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况，还需进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验。

　C.7.1.4 链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2mL（0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液），加入0.8mL灭菌生理盐水，混匀后再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL，混匀，放36℃±1℃水浴中，2min 观察一次（一般10min 内可凝固），待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2h 内不溶化，继续放置24h 观察，如凝块全部溶化为阳性，24h仍不溶化为阴性。

　C.7.1.5 杆菌肽敏感试验：将被检菌悬液涂于血琼脂平皿上，用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平皿表面上，同时以已知阳性菌株作对照，在36℃±1℃下放置24h～48h，有抑菌带者为阳性。

　C.7.2 结果报告 镜检革兰阳性链状排列球菌，血琼脂平皿上呈现溶血圈，链激酶和杆菌肽试验阳性，可报告被检样品检出溶血性链球菌。

　C.8 真菌菌落总数检测方法 C.8.1 操作步骤 按F.2得到的生理盐水或中和剂样液自然沉降后取上清液，如需要可进行10倍系列稀释。选择适宜的稀释度进行真菌菌落计数。共接种2个平皿，每个平皿中加入2.0mL样液，然后用冷却至40℃～45℃的熔化的沙堡弱琼脂培养基或改良沙堡弱琼脂培养基15mL～20mL倒入每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿置25℃±1℃（沙堡弱琼脂培养基）或28℃±1℃（改

　良沙堡弱琼脂培养基）培养3天，分别于第1天、第2天、第3天观察，计算平皿上的菌落数，如果发现菌落蔓延，以前一次的菌落计数为准。

　C.8.2 菌落计数 菌落呈片状生长的平皿不宜采用；确保2块平皿符合计数要求并进行菌落计数，按式(F.2)计算结果：

　2 20K BB t

　..................................... (F.2) 式中：

　B t ——真菌菌落总数，单位为每克菌落形成单位（CFU/g）

　或每毫升菌落形成单位（CFU/mL）； B 0 ——

　2块沙堡弱琼脂培养基或改良沙堡弱琼脂培养基平皿上的真菌菌落总数；

　K——

　稀释倍数； （2×2）——2块平皿，每块平皿接种2mL样液。

　当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字；当2块沙堡弱琼脂培养基或改良沙堡弱琼脂培养基平皿上真菌菌落总数＜1时，应报告真菌菌落总数＜5 CFU/g (CFU/mL)。

　C.8.3 结果报告 C.8.3.1 如经首次检测，样品菌落总数符合本标准的规定，直接按检测结果报告。

　C.8.3.2 如经首次检测，样品菌落总数超过本标准的规定，应用留存的备检样品依前法复测2次，然后才能报告结果。当2次复测结果都达到本标准的规定，则判定被检样品合格，以2次合格结果的均值报告；其中有任何1次复测结果超过本标准规定，则判定被检样品不合格，以所有不合格结果的均值报告。

　C.9 真菌定性检测方法 C.9.1 操作步骤 取样液5mL加入到50mL沙堡弱...