从马铃薯中提取甘皮素通过PI3KAkt介导Nrf2信号通路在体外保护胃上皮细胞免受H2O2诱导氧化损伤

从马铃薯中提取的甘皮素通过PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路在体外保护胃上皮细胞免受H2O2诱导的氧化损伤 本研究旨在探讨马铃薯新提取物的抗氧化机制。采用高效液相色谱法(HPLC)从马铃薯中提取了4种色素:马铃薯红素、丹皮素、麦维丁和天竺葵苷。我们的结果显示，不同浓度的过氧化氢(甘皮素)处理后，胃粘膜上皮细胞(gs -1)的细胞形态和细胞活力随着时间的推移而发生显著改变(P < 0.05)。Paeonin对经过甘皮素处理的细胞表现出最强的抗氧化作用，且这种作用的时间和剂量依赖于are -荧光素酶活性和甘皮素-1 mRNA的表达。甘皮素暴露细胞经Paeonin预处理后，Keap1、Nrf2、甘皮素-1和NQO1蛋白表达明显上调。此外，甘皮素+ Paeonin组Nrf2表达的免疫染色随时间明显升高。

甘皮素+ Paeonin组GSH含量明显低于甘皮素+ Paeonin + GSK690693组。2 Paeonin通过增强Cyclin D1和p27蛋白的表达来促进细胞周期。此外，Paeonin通过增加Bcl2、总Caspase3和总Caspase8蛋白表达抑制甘皮素处理细胞的凋亡，降低Bax、p-Caspase3和p-Caspase8蛋白的表达。这些结果提示，丹皮素可能通过激活Nrf2信号通路，改变细胞周期和凋亡，从而发挥抗氧化作用。

慢性胃炎、腺癌、十二指肠及胃溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃疾病给医疗系统带来巨大的经济负担，严重降低了生活质量。因此，需要国际关注，以帮助解决这些疾病造成的全球疾病负担。越来越多的实验和临床证据表明，在大多数情况下，慢性氧化应激增加是胃疾病的主要病理特征，在胃疾病的多次进展中起重要作用。例如，乙醇诱导的大鼠胃溃疡可引起脂质过氧化和丙二醛升高，最终导致粘膜氧化应激损伤;但在给予抗氧化剂和/或抗氧化酶后，通过抑制氧化应激损伤对乙醇性胃溃疡有保护作用。

氧化应激被定义为活性氧(ROS)生成与内源性抗氧化防御系统的失衡。在正常生理条件下，哺乳动物细胞产生的ROS可通过抗氧化防御分子如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白等有效降解。然而，异常和过量的活性氧生成可能会导致不可缺少的生物分子的严重氧化损伤，包括蛋白质、脂类和核酸。在各种活性氧中，过氧化氢(甘皮素)是一种稳定的、小的、不带电荷的分子，作为生理上的第二信使，在细胞膜上自由扩散。而且，几乎在每一个阶段都有繁殖氧化循环和启动的脂质过氧化、线粒体损伤、DNA损伤等，也被广泛应用于体外诱导氧化应激。

根据上述研究，如果干预策略能够改善氧化应激过程或相关途径，则可能适用于改善胃病的临床症状。然而，核因子- e2相关因子-2 (Nrf-2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路是细胞抵抗氧化应激的主要机制，其蛋白产物参与解毒和消除反应性氧化剂的基因表达。此外，许多研究者认为，富含抗氧化剂的食物，如苹果、草莓、番茄、胡萝卜等，能够清除活性氧，最终降低胃粘膜氧化损伤的风险。因此，在本研究中，我们试图探索马铃薯成分或提取物的抗氧化作用，抑制氧化应激损伤，并进一步探讨这些材料的Nrf2/ARE信号通路在抑制氧化应激损伤中的潜在机制。

材料和方法 细胞培养和过氧化氢(甘皮素)处理。

人胃粘膜上皮细胞系gs -1细胞购自American Type Culture Collection (ATCC)，于Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640;吉布科，德国)完全培养基，补充10%胎牛血清(胎牛血清;在5% CO的湿化环境中，每隔2天更换培养基，当gs -1细胞达到80~90%融合时，使用0.25%胰蛋白酶(Sigma, USA)消化细胞进行传代培养。gs -1细胞以1×10细胞/孔的密度接种于6孔板中，置于37℃5%共湿培养箱中过夜。

达到80%融合,GES-1细胞处理0μM 100μMμM 200和400μM 甘皮素 24 h。随后,根据细胞生存能力的考试,我们选择一个合适的浓度对以下实验细胞的可行性分析。简单地说，根据制造商的说明，使用不同浓度的MTT试剂盒(Promega, USA)对经处理的gs -1细胞进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)测定细胞存活率。22 然后,培养GES-1细胞与不同浓度的甘皮素were镀在96 -孔板24 h,然后孵化20μl 5毫克/毫升MTT试剂在37°C 4 h。后来,150μl二甲亚砜(DMSO)的解决方案是添加到每一个紫色甲瓒晶体溶解,伴随着连续摇晃在室温下15分钟,最后的吸光度,包括空白没有细胞,用美国Bio-Rad分光光度计在490 nm波长下测量。

此外，根据以上实验结果，我们选择了gs -1细胞中经过甘皮素处理后的细胞活力最小值，并进一步检测了在选择的甘皮素concentration下孵育0 h、3 h、6 h、12 h和24 h的gs -1细胞活力。

采用高效液相色谱法对马铃薯中色素的提取进行了研究。这些色素是从土豆中提取出来的，使用的化学试剂购自美国费雪科学公司，根据相关制造商的协议。然后用Agilent HPLC仪器(Agilent, USA)对提取的色素进行分析，仪器由G1311A四元泵、G1322A除气器、G1314A紫外(UV)检测仪、G1316A柱、HPLC ChemStation软件组成。分析条件为:C柱，2.1×7.5 mm，防护柱(内径4.6 mm)(安捷伦，美国);18流动相为溶液(甲酸酸化水，pH = 3.0)和B溶液(甲醇)，呈阶梯梯度，流速为0.5 ml/min;检测波长从525nm处观察到。

抗氧化反应元件(ARE)-荧光素酶活性测定。按照制造商的建议，使用Lipofectamine2000 (Invitrogen，美国)将gs -1细胞接种到24孔板中，从中国Biolab获得的报告基因质粒转染到gs -1细胞中。TM 转染24小时后,转染细胞治疗与400年μM 甘皮素alone和400μM 甘皮素 +四个提取色素,分别为24 h。最终,ARE-luciferase被测量通过添加荧光素酶的活性测定试剂(美国Promega)根据制造商的指导方针由分光光度计波长490纳米。此外,根据以上实验结果,我们选择最大的ARE-luciferase活动GES-1细胞甘皮素 +色素治疗,并进一步研究ARE-luciferase活动GES-1细胞与不同浓度的选择颜料孵化1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h和24 h。

定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测。使用Trizol试剂(TIANGEN, China)按照制造商的说明分离上述不同处理的收获的gs -1细胞的总RNA，使用DNase处理(Thermo, USA)清除RNA制剂中污染的基因组DNA。长串互补DNA合成(互补)从0.5 mRNAμg总RNA进行使用的PrimeScript 7500快速实时试剂盒RT PCR(日本豆类、系统)。(Applied Quantitative Biosystems, analysis USA)根据制造商的协议，使用血红素a氧合酶-1 SYBR®Premix (甘皮素-1)Ex Taq™II (Tli RNaseH Plus)试剂盒。变性的PCR条件由1周期在30年代95°C,然后在95°C 40周期的变性5 s,退火60°C 34 s(数据收集最后60°C的步骤在每一个周期),和离解为15秒95°C, 60°C 1分钟和15秒95°C。甘皮素-1定量数据归一化至18S rRNA表达水平，用2法计算。−ΔΔCt 18用于qRT-PCR的引物序列如下:甘皮素-1正向引物，5 ＇ -TGAAGGAGGCCACCAAGGAGGA-3 ＇， 甘皮素-1反向引物，5 ＇ - agaggtcacccgtagcggg -3 ＇;18S rRNA正向引物，5 ＇ -CCTGGATACCGCA GCTAGGA-3 ＇， 18S rRNA反向引物，5 ＇ -GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3 ＇。

免疫蛋白印记(WB)。GES-1细胞样品的孵化μM 甘皮素 400 + 200μg /毫升Paeonin 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h和24小时收集通过MTT实验来测量细胞的生存能力,这是上面所描述的那样,由世行和Nrf信号pathway-related蛋白质分析。全细胞溶解产物中所有样品准备pre-cooled radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲(美国热)包含50 mM Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,0.1%诺乃清洁剂p 40,和蛋白酶抑制剂的混合物或磷酸酶抑制剂在冰上40分钟。总蛋白质浓度与BCA量化分析工具(Beyotime,中国),使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。细胞溶解产物混合2×加载缓冲区(Beyotime,中国),煮沸变性的8分钟然后解决8 ~ 10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)(30μg /)。跑后为1.5 h的恒定电压120 V,蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h的恒流200 mA,封锁在5%脱脂牛奶在室温下2小时,兔子和孵化anti-Nrf2主要抗体(1:1000稀释;兔抗甘皮素 -1一抗(1:1000稀释;兔抗nqo1一抗(1:2000稀释;兔抗p甘皮素sp甘皮素- akt (p-Akt)一抗(1:1000稀释;兔抗akt一抗(1:2000稀释;美国Abcam),或鼠标anti-β-actin(1:1000稀释,作为内部控制;美国阿布卡姆)4℃过夜。用0.1% t吐温-20 (TBST)三次tris缓冲盐水广泛冲洗后，分别用相应的二抗(山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG)对膜进行检测(均用5%脱脂牛奶1:12000稀释);在室温下放置1小时，然后用TBST洗涤3次。最后，使用增效化学发光试剂(Beyotime，中国)和ImageQuant LAS 4000 mini系统(GE Healthcare，日本)检测印迹，并使用ImageJ软件分析蛋白条带的密度。

谷胱甘肽(GSH)含量检查。GES-1细胞被镀上6-well菜(1×105个细胞/),和第二天细胞暴露在甘皮素alone,何鸿燊+ Paeonin和甘皮素 + Paeonin + GSK690693 (PI3K / Akt信号通路的抑制剂)24 h。然后,刮细胞细胞溶解在5%偏磷酸和用冰。

以12000rmp离心10分钟后，使用商品化的GSH测定试剂盒(中国南京建成生物科技有限公司)检测上清液中细胞内的GSH水平。用分光光度计在400nm处读取每个样品的吸光度。

免疫荧光显微镜(IF)。将gs -1细胞接种在12孔板上，预先放置无菌玻璃容器，放置于37℃、5%的共培养箱中过夜。第二天,细胞被孵化甘皮素alone和甘皮素 + Paeonin 2 h, 8 h和12 h。在指定的时间,治疗后细胞用磷酸缓冲盐(PBS)两次,在室温下和4%多聚甲醛固定30分钟,然后用1% permeabilized Triton x - 100 10分钟。与5% BSA阻塞后30分钟在37°C, anti-Nerf主要抗体的细胞染色(1:10 0稀释)一夜之间在4°C。

PBS洗涤3次，pe标记山羊抗兔二抗(1:1000稀释;(美国)37℃孵育1小时。PBS洗涤3次后，用1 mg/ml的DAPI (Beyotime, China)复染细胞5分钟，用抗褪色试剂(Solarbio, China)复染细胞。最后，用激光扫描共聚焦显微镜(莱卡，德国)观察并捕获图像。

流式细胞术。为了检测经甘皮素and处理的gs -1细胞的细胞周期和凋亡情况，以评估Paeonin的作用，我们使用FACSCalibur系统(BD Biosciences, USA)进行了流式细胞术实验。细胞周期分析:收集的细胞用PBS洗涤，离心，在- 20℃70%乙醇中过夜。此后,细胞染色400μl染色解决方案包含100毫克/毫升的核糖核酸酶A和40毫克/毫升的propidium碘(π)在黑暗中30分钟在37°C,紧随其后的是流式细胞术分析。对于细胞凋亡分析,收集到的细胞同样用PBS,离心机,并在250年resuspendedμl膜联蛋白V绑定缓冲。使用FITC-Annexin V凋亡检测试剂盒(Beyotime, China)，在37°C条件下，用FITC-Annexin V和PI在黑暗中进行双重染色15分钟后，根据制造商的协议，在流式细胞仪上对30分钟内的细胞进行分析。此外，我们还通过上述操作，通过WB测定细胞周期相关蛋白(如Cyclin D1和p27)和凋亡相关蛋白(如Bcl2、Caspase3、Caspase8和Bax)，进一步揭示甘皮素alone和甘皮素+ Paeonin处理的gs -1细胞的细胞周期和凋亡分布。

数据的统计分析。本研究所有数据均采用SPSS 18.0软件(IBM SPSS, USA)进行分析。所有实验均进行了至少3次生物重复，数据以均数±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析(ANOVA)评估两组间的差异。两组间比较采用双尾t检验。P值小于0.05为显著性。

结果：
氧化损伤模型的建立。为了研究甘皮素的氧化损伤，我们用不同浓度的甘皮素at处理gs -1细胞。发现GES-1细胞0μM 甘皮素treatment形态正常,而GES-1细胞与其他浓度甘皮素treatment显示一个不完整的细胞形态,特别是在400年μM 甘皮素group(图1)。此外,细胞生存能力的比率在400年μM 甘皮素group明显低于其他三个组(图1 b)。此外,研究还发现,400年μM 甘皮素induced比例减少的细胞生存时间的方式(图1 c)。

因此,我们选择400μM,作为最佳剂量和24小时,作为后续实验的最佳时期。

图1所示：建立了甘皮素is诱导的gs -1细胞氧化损伤模型。(A)形态变化GES-1细胞暴露于4不同浓度的甘皮素包括0μM 100μM 200μM和400μM。(B)通过MTT法测定不同浓度的甘皮素对gs -1细胞活力的影响。细胞活力呈剂量依赖性逐渐下降;* P < 0.05。(C) 400年影响μM胡恩GES-1细胞细胞生存能力为0 h, 3 h, 6 h、12 h和24 h。细胞生存能力逐渐下降时间的方式; * P < 0.05。

从马铃薯中提取的四种色素修复了甘皮素处理的gs -1细胞的氧化损伤。我们的结果显示，从马铃薯中分离出四种色素，即马铃薯球蛋白、丹皮素、麦维丁和天竺葵色素(图2A)。为了确定这四种色素是否可以通过热处理减轻gs -1细胞的氧化损伤，我们将gs -1细胞与这四种色素进行预孵育。

结果表明，与GSE-1和甘皮素groups相比，这四种色素，特别是丹皮素能显著促进稀土-荧光素酶活性。

而稀土-荧光素酶的活性则代表了细胞的抗氧化状态;因此，我们的结果表明，这四种色素可以减少甘皮素诱导的细胞氧化应激损伤。同时，由于Paeonin激活了ARE-luciferase reporter的最高信号，因此被选为后续实验的最佳色素(图2B)。

丹皮素具有抗氧化和提高细胞活力的作用。为了证实丹皮酚的抗氧化作用，我们采用不同浓度的丹皮酚对gs -1细胞进行不同时间的预处理。我们的数据表明,ARE-luciferase活动(图3)和甘皮素-1 mRNA表达(图3 b)在GES-1细胞与不同浓度的Paeonin pre-incubated治疗400年μM 甘皮素之前,都逐渐增加剂量依赖性的方式。接下来,我们选择200μg /毫升Paeonin GES-1细胞预处理,然后用400μM 甘皮素to孵化为0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h和24 h。结果表明:ARE-luciferase活动(图3 c)和甘皮素-1 mRNA表达(图3 d)与时间也明显升高GES-1细胞甘皮素 + Paeonin治疗。此外，甘皮素+丹皮素处理的gs -1细胞中，细胞存活率的比例随时间显著上调(图4A)。

因此，这些结果表明，丹皮素不仅具有抗氧化作用，还可以促进氧化损伤细胞模型的细胞存活。

Nrf2信号通路和PI3K/Akt信号通路可能参与了丹皮素的抗氧化机制。为了进一步探索Paeonin是否激活了Nrf2信号通路以提高其抗氧化作用，我们首先通过WB检测了Nrf2信号相关蛋白的表达水平。我们的结果发现，Keap1、Nrf2、甘皮素-1和NQO1蛋白表达在0 h、1 h、2 h和4 h时表达较弱，但在8 h、12 h和24 h时表达明显增强(图4B)。然而，p-Akt蛋白表达从0 h逐渐升高至4h，从4h逐渐降低至24h，但各时间点的Akt蛋白表达均无明显变化(图4B)。此外，IF图像也显示Nrf2的荧光强度随时间显著上调(图4C)。因此，这些结果提示Paeonin随着时间的推移激活了Nrf2信号通路。随后，我们使用了PI3K/Akt信号通路抑制剂(即PI3K/Akt信号通路抑制剂)。， GSK690693)，以证明丹皮素的增殖促进作用。我们的数据显示，与甘皮素and 甘皮素+ Paeonin组相比，甘皮素+ Paeonin + GSK690693处理导致细胞内GSH含量相对下降(图4D)。

因此，我们认为PI3K/Akt信号通路可能参与了甘皮素处理的GSE-1细胞的氧化损伤修复。

丹皮素治疗促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。为了进一步阐明芍药苷在甘皮素处理的GSE-1细胞中的修复机制，用流式细胞术检测细胞周期和凋亡。如图5A所示，甘皮素显着引起细胞周期阻滞; 但经丹皮素预处理后，细胞周期得到改善。此外，我们还发现甘皮素treatment可以显著促进gs -1细胞的凋亡，而甘皮素+芍药苷处理的GSE-1细胞的凋亡则被下调(图5B)。

甘皮素+ Paeonin组细胞周期蛋白D1、p27、Bcl2、总Caspase3、总Caspase8表达水平明显高于甘皮素group;而甘皮素+ Paeonin组Bax、p-Caspase3、p-Caspase8蛋白表达水平明显低于甘皮素group组(图5C)。使用Image J分析软件通过密度测定定量的相对蛋白表达水平如图5D所示。因此，这些结果表明，丹皮素可以加速甘皮素处理的GSE-1细胞的增殖，减缓细胞凋亡。

图2：从马铃薯中提取的色素在经甘皮素处理的gs -1细胞中的作用。(A)采用高效液相色谱法检测从马铃薯中分离的色素。有四个显著的峰值(即(B)用从马铃薯中提取的四种色素预孵育甘皮素处理的gs -1细胞，检测其在20 ~ 26分钟内的ARE-luciferase活性。与gs -1和甘皮素groups相比，四种提取色素均提高了ARE-luciferase的活性。在甘皮素处理的gs -1细胞中，丹皮素可诱导产生最高的稀土-荧光素酶活性;与甘皮素group比较，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。

图3：丹皮素的抗氧化作用。(A) ARE-luciferase活动被荧光素酶试验测量甘皮素-stimulated GES-1细胞与不同浓度Paeonin,包括20μg / ml, 50μg /毫升,100μg /毫升和200μg /毫升。随着丹皮素浓度的增加，荧光素酶活性也随之升高。(B)用qRT-PCR检测不同Paeonin浓度的甘皮素-1细胞中甘皮素-1 mRNA的表达。甘皮素-1 mRNA表达与芍药苷浓度呈正相关。(C)——荧光素酶活性检测荧光素酶测定在甘皮素-stimulated GES-1细胞200μg /毫升Paeonin 1 h, 2 h, 4 h, 8 h、12 h和24 h。治疗时间延长,ARE-luciferase活动也差异。(D) 甘皮素-1信使rna测试中存在的甘皮素-incubated GES-1细胞200μg /毫升Paeonin 1 h, 2 h, 4 h, 8 h、12 h和24 h。甘皮素-1 mRNA表达和治疗时间有正相关;*与甘皮素group比较P < 0.05。

图4：丹皮素通过PI3K/ akt介导的Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。(A)细胞生存能力测试通过MTT测定甘皮素-incubated GES-1细胞200μg /毫升Paeonin 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h和24 h。细胞生存能力提出了一个时间增加。(B) PI3K / Akt-mediated Keap-1 Nrf2信号通路相关蛋白的表达是由世行在甘皮素-exposed GES-1细胞200μg /毫升Paeonin 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h、12 h和24 h。(C)的位置表达了Nrf2如果甘皮素-stimulated GES-1细胞200μg /毫升Paeonin 2 h, 8 h和12 h。细胞核被染成蓝色,而Nrf2蛋白质染色成红色。(D)在GSE-1、甘皮素、甘皮素+ Paeonin和甘皮素+ Paeonin + GSK690693组中检测GSH含量。三组GSH含量均高于GSE-1组;* P < 0.05 图5：丹皮素对细胞周期和凋亡的影响。GSE-1细胞被分为三组:GSE-1集团、甘皮素group和甘皮素plus 200μg /毫升Paeonin组。

(A)流式细胞术检测细胞周期。给出了具有代表性的细胞周期图像。(B)流式细胞术检测细胞凋亡。展示了细胞凋亡的典型图像。(C)通过WB检测细胞周期和凋亡相关蛋白。其中，cyclin D1、p27为细胞周期相关蛋白，Bcl2、Caspase3、p-Caspase3、Caspase8、p-Caspase8、Bax为凋亡相关蛋白。GAPDH被认为是内源性参考。(D)计算cyclin D1、p27、Bcl2、Caspase3、p-Caspase3、Caspase8、p-Caspase8、Bax蛋白的相对表达，并以直方图表示。

讨论：
氧化应激在胃病的发病过程中起着重要的作用。在本研究中，我们的结果首先表明，gs -1细胞在暴露后出现了明显的形态变化和剂量-时间依赖性细胞活力丧失，这与其他研究一致。因此，这些结果表明，成功地建立了gs -1细胞的氧化应激模型。从马铃薯中提取色素，用高效液相色谱法进行纯化。此外，在四种分离的色素中，丹皮素对暴露于甘皮素的gs -1细胞的抗氧化作用最强。目前，增加饮食抗氧化剂的摄入是降低胃粘膜氧化损伤的最佳选择，这已被广泛认识。此外,在我们之前的研究中,它已经表明,花青素提取“Jianchuan甘皮素”和“Zhuanxinwu”土豆以浓度依赖方式具有很强的抗氧化活性和透露一个重要的自由基清除能力的10.7 ~ 31.3倍,维生素C,这表明,土豆有抗氧化效果。因此，为了进一步证实Paeonin在保护gs -1细胞免受氧化损伤中的作用，我们分别通过荧光素酶检测和qRT-PCR检测了在经过甘皮素处理的gs -1细胞中表达抗氧化能力的are -荧光素酶活性和甘皮素-1 mRNA的表达。我们的数据显示，Paeonin以剂量和时间依赖的方式上调了经甘皮素处理的gs -1细胞的are -荧光素酶活性和甘皮素-1 mRNA的表达，表明Paeonin可能在经甘皮素处理的gs -1细胞中发挥抗氧化作用。此外，我们还发现，Paeonin处理后，在甘皮素培养的gs -1细胞中，随着时间的延长，细胞存活率逐渐升高，进一步说明Paeonin可以减轻gs -1细胞在甘皮素treatment处理后的细胞损伤。

为了进一步挖掘丹皮素抗氧化损伤的潜在机制，人们越来越关注的主要是Nrf2信号通路，它是一种氧化还原敏感的转录因子，在正常条件下定位于细胞质并与keap1相互作用。一旦被激活，Nrf2进入细胞核，结合靶基因启动子的抗氧化反应元件，导致各种抗氧化和解毒酶的转录，并最终显示出细胞保护作用。越来越多的研究表明，Nrf2通路的激活是本研究治疗胃病的一个治疗靶点。

研究发现，在经过丹皮素处理的甘皮素-1细胞中，Keap-1、Nrf2、甘皮素-1和NQO1明显升高。此外，经过甘皮素处理的gs -1细胞中Nrf2的荧光强度也随着丹皮素处理时间的延长而增强。Nrf2被认为是一种转录因子，在氧化应激条件下从kelch样的ech相关蛋白-1 (Keap1)中解离，然后进入细胞核，与ARE结合，导致抗氧化基因(包括甘皮素-1和NQO1)的转录激活。此外，在过去的几十年里，各种研究表明，增强核内Nrf2或改善其下游基因可以有效地保护细胞免受氧化应激引起的细胞损伤。例如，水杨酸通过激活Nrf2信号通路抑制氧化应激诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤，绿原酸通过PI3K/ akt介导的Nrf2/甘皮素-1信号通路保护小鼠成骨细胞MC3T3-E1免受甘皮素诱导的氧化应激。因此，我们的研究结果表明，Paeonin可能通过激活Nrf2信号通路来阻止甘皮素刺激的gs -1细胞的氧化损伤。此外，PI3K/Akt信号通路的激活被认为是Nrf2信号通路激活的关键上游事件;因此，在不同的细胞中，PI3K/Akt信号通路以nrf2依赖的转录方式调节抗氧化基因的表达，以应对氧化应激。同时，在本研究中，经Paeonin处理后，甘皮素暴露的gs -1细胞中，p-Akt蛋白表达呈抛物线型趋势，在8 h时达到峰值。此外，与甘皮素group和甘皮素+ Paeonin组相比，PI3K/Akt信号抑制剂GSK690693明显抑制H202+ Paeonin + GSK690693组的GSH含量。

然而，细胞中GSH水平的积累反映了氧化应激的抑制状态。因此，这些结果表明，Paeonin的抗氧化保护作用可能是由PI3K/ akt介导的Nrf2信号通路介导的。

结论：
最后，通过流式细胞术和WB检测细胞周期和凋亡情况。我们的数据表明，丹皮素治疗可以显著改善甘皮素对细胞周期阻滞和gs -1细胞凋亡的影响。

目前已经证实甘皮素诱导的细胞周期阻滞和凋亡是细胞损伤的关键指标。此外，与甘皮素刺激的gs -1细胞相比，WB实验也验证了Paeonin可以促进细胞周期相关的Cyclin D1、p27和抗凋亡相关的Bcl2蛋白表达，抑制促凋亡相关的Bax、p-Caspase3和p-Caspase8蛋白表达。22因此，这些结果提示丹皮素对甘皮素诱导的细胞损伤是有效的。

综上所述，我们提供了第一个证据，证明从土豆中提取的丹皮素通过一种机制，至少部分依赖于PI3K/ akt介导的Nrf2信号通路的激活，从而对甘皮素诱导的氧化应激损伤产生细胞保护作用。本研究强调了丹皮素作为逆转胃部疾病氧化应激的新靶点的价值。