[靶向人VEGF165的SiRNA慢病毒的构建和鉴定] 靶向治疗痛苦吗

　　[摘要]目的：构建靶向VEGF基因的SiRNA慢病毒载体，并包装病毒。 方法：针对已经筛选确定的SiRNA 有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，经双酶切后与PGC SIL-GFP慢病毒载体连接，构建慢病毒载体PGCSIL-SiVEGF，以293T细胞包装得到干扰病毒LV-SiVEGF，根据细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度；病毒感染人脐静脉内皮细胞HUVEC，通过定量RT-PCR检测VEGF的mRNA表达。结果：测序结果表明，靶向人VEGF的SiRNA慢病毒载体构建成功，包装后的慢病毒滴度为2×109 ifu/μl；感染HUVEC细胞后，实验组和对照组相比VEGF mRNA表达水平显著降低。结论：成功构建人VEGF SiRNA 慢病毒LV-SiVEGF。
　　[关键词]VEGF；慢病毒载体；RNA干扰技术
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1084-03
　　
　　Construction and identification of lentivirus of RNA interference
　　targeting VEGF165 gene
　　LIU Bei,MA Ge-jia,SONG Bao-qiang
　　(Department of Plastic Surgery,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi"an,710032 Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo construct a lentiviral vector of RNA interfence (siRNA) of VEGF165 gene, and preparing mature virus.MethodsThe effective sequence of siRNA targeting VEGF165 was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was synthesized and cloned into the PGC SIL-GFP lentivector obtaining the VEGF165 siRNA virus vector named pGCSIL-SiVEGF. 293T cells were cotransfected with pGCSIL-SiVEGF and lentivirus packaging plasmids mixtures to prepare the mature virus named LV-SiVEGF. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP.The human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) was transfected by the LV-SiVEGF. We detected expression levels of VEGF mRNA of HUVEC by RealTime-PCR.ResultsPCR and DNA sequencing demonstrated that the lentivirus RNAi vector of VEGF was constructed successfully. The titer of concentrated virus was 2×109 ifu/μl. VEGFmRNA expression levels of the experimental HUVEC were significantly lower than the control group (73.3%).ConclusionsVEGFsiRNA lentiviral was successfully constructed.
　　Key words:VEGF;lentivirus;RNA interference
　　
　　增生性瘢痕常发生于烧、创伤及手术后，在中国人中有很高的发病率，但目前缺乏理想的治疗措施。而增生期瘢痕具有丰富的血运，许多研究表明血管生成是瘢痕形成的一个重要因素[1-4]。VEGF是最重要的促血管生成因子，我们拟通过抑制血管生成作用抑制瘢痕增生，本实验室在2008年已成功筛选了针对VEGF基因的SiRNA干扰序列，并构建了干扰质粒[5]，但由于质粒的转染效率不高，且不能稳定表达，因此本研究拟构建靶向干扰人VEGF的慢病毒载体。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料：293T细胞 HUVEC细胞（本实验室保存）、慢病毒载体系统（吉凯公司），Lipofectamine2000（invitrogen公司），大肠杆菌菌株（本实验室保存），培养基：DMEM 基础培养液（Hyclone公司）中添加体积分数10%的胎牛血清(Hyclone公司)， 100U/ml 青霉素和100mg/L链霉素。胰酶（sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），反转录试剂盒，SYBR GREEN I，及PCR相关试剂（Takara公司），RNase -free 的实验耗材（Axygen公司）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 慢病毒载体构建：根据前期研究确定干扰序列为GTGGTGAAGTTCATGGATG，根据该序列设计并合成其ShRNA干扰序列的双链的DNAoligo，正义链和反义链间插入9bp的发夹结构TTCAAGAGA，以TTTTT为转录终止密码子，尾部引入Age I和EcoRI酶切位点，同时设计合成无意义序列作为阴性对照。经退火形成双链DNA，与经Age I和EcoRI双酶切后的慢病毒载体pGCL-GFP进行连接反应，转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆，进行测序鉴定，提取质粒分别命名为PGCSIL-SiVEGF及PGCSIL-NC。
　　1.2.2 慢病毒包装：用含10%FBS的DMEM培养293T细胞，观察细胞生长状态良好，在转染前24h用0.25%的胰酶消化对数生长期的293T细胞，以培养基调整细胞密度为1.2×107 细胞/20ml，重新接种于15cm 细胞培养皿，37℃，5% CO2培养箱内培养。24h 待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。取慢病毒载体PGCSIL-SiVEGF 20μg, pHelper 1.0 载体15μg，pHelper 2.0 载体10μg， Opti-MEM 培养基适量混合均匀，再加入100μl Lipofectamine 2000与2.4ml Opti-MEM 的混合物，将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T 细胞的培养液中，混匀，培养8h后倒去培养基，用 PBS 清洗后加入不含抗生素的新鲜培养基（含10%FBS）培养48h。收集感染后的细胞上清，即为成熟病毒命名为LV-SiVEGF，阴性病毒采用相同的操作，命名为LV-NC。4000g 离心10min去除细胞碎片,用0.45μm滤膜过滤上清液，使用Plus-20离心超滤装置对病毒液进行浓缩，操作按照MILLIPORE的使用说明，浓缩后的病毒置于-80℃保存。
　　1.2.3 滴度测定：在96 孔板中接种293T细胞，每个孔加4×104。培养24h后将LV-SiVEGF及LV-NC浓缩液用DMEM培养液稀释成每100μl 中含10μl、 1μl、 10-1μl、10-2μl、10-3μl、10-4μl、10-5μl、10-6μl几个浓度梯度的病毒液，取100μl稀释后的病毒液分别感染293T细胞。培养24h后更换新鲜完全培养基继续培养，4 天后，用倒置荧光显微镜（尼康公司Ti-U）观察荧光表达情况。带有荧光的细胞数除以病毒原液量计算病毒的滴度。
　　1.2.4 感染HUVEC细胞：HUVEC细胞用含10%胎牛血清的1640培养基培养,用胰酶消化后接种于24孔板内，每孔4×104,培养24h, 分为干扰组、对照组、空白细胞组，待细胞密度达30%左右时弃培养液，按照MOI值为50分别加入适量的病毒溶液LV-SiVEGF、LV-NC及DMEM培养基,8h后更换新鲜的完全培养基继续培养。96h后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达。
　　1.2.5 RT-PCR：每组收集一批细胞行RT-PCR测定VEGF基因 mRNA表达情况。用Trizol试剂提取细胞总RNA，以Takara公司反转录试剂盒，按照试剂盒说明书操作，取1ug总RNA反转成cDNA，采用SYBR Green 染料法在荧光定量PCR仪（Agilent公司 Mx3005P）上检测目的基因的表达。设计引物为：上游5"-cccactgaggagtccaacat-3"，下游：5"-tttcttg cgctttcgttttt-3"。定量PCR反应程序：95℃、10 min；变性95℃、15 S；退火55℃、30 S反应45个循环，延伸72℃10min；扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃、1min，65℃、1min，以0.10℃/S的速度升温到95℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行3次Real-time PCR检测，取平均值。用随机附带的软件进行目的基因的相对定量表达分析。
　　
　　2结果
　　2.1 慢病毒载体的鉴定：通过载体上的引物（F primer：5"- CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3"）对扩增质粒进行测序，结果与设计的序列一致，表明慢病毒载体构建成功。
　　2.2 慢病毒滴度测定：共转染96h后在倒置荧光显微镜下观察，可见GFP的表达，随着病毒稀释倍数的增加表达绿色荧光的293T细胞数目越来越少（见图1），从图片A-H依次为加入LV-SiVEGF浓缩液10μl、 1μl、 10-1μl、10-2μl、10-3μl、10-4μl、10-5μl、10-6μl几个浓度梯度，当稀释倍数为10-6时视野里有2个细胞表达GFP，因此LV-SiVEGF滴度测试的结果为2×109,即每毫升病毒浓缩液中含有2×109个病毒颗粒。同法测得LV-NC的滴度为5×109。
　　2.3 慢病毒载体感染HUVEC细胞： 病毒感染HUVEC细胞后96h观察荧光表达情况，通过在明场视野和荧光镜下的对比可估算LV-SiVEGF及LV-NC的感染效率均为80%左右（图2）。
　　2.4 基因干扰效率的检测：荧光定量检测VEGF基因扩增及溶解曲线照片见图3，溶解曲线为单峰说明产物单一。相对定量结果（图4）显示LV-SiVEGF感染的细胞组较之LV-NC组VEGF组显著降低，定量PCR检测结果干扰效率为73.3%
　　3讨论
　　3.1 血管内皮生长因子VEGF是目前研究发现最重要的血管生成因子，最初发现时由于其强大的促血管渗透作用而被称为血管渗透因子（vascular permeability factor，VPF）[6]。随着研究的深入，发现VEGF家族有多个成员，包括VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D，PDGF等[7]。VEGF家族成员通常是一种糖蛋白，是由两个亚基组成的同源二聚体。我们通常所说的VEGF及最初命名的VPF实际上是指VEGF-A。VEGF-A基因位于6号染色体的短臂上，它有8个外显子，选择性的剪切可以形成多个异构体，主要常见的成熟亚型有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，分别由121、145、165、189和206个氨基酸组成。VEGF-A在体内具有多重生物学作用，包括增加血管渗透性，诱导血管生成，血管发生，促进内皮细胞增殖、迁移，抑制血管内皮细胞凋亡等[8]。
　　3.2 研究表明增生期瘢痕具有丰富的血运，血管生成是增生性瘢痕形成的一个重要因素。而VEGF-A在这个过程中发挥着至关重要的作用，因此我们拟通过RNA干扰技术抑制VEGF-A的表达来抑制瘢痕增生。在VEGF-A的几种异构体中，VEGF165是目前已知对血管生成作用最强的细胞因子，因此本实验所设计的干扰的靶序列是针对的人VEGF165。
　　3.3 RNA干扰技术是基于转录后沉默机制，具有高效性和特异性，已被广泛应用于基因功能研究和药物研究。siRNA是发挥RNA干扰作用的分子，通过化学合成和体外转录发可以制备SiRNA，但SiRNA进入细胞易被RNA酶降解。因此通过质粒或病毒为载体介导的SiRNA可以克服以上缺点，前期我们已经制备了针对VEGF165的质粒，但是质粒转染效率低(转染效率小于10%)，持续时间短，脂质体对细胞毒性大。因此我们拟构建慢病毒介导的VEGF165干扰质粒，慢病毒属于逆转录病毒家族 ,能感染分裂期和非分裂期细胞 ,转染效率高、转染细胞稳定、病毒滴度高[9]。
　　3.4 本实验使用的慢病毒骨架载体PGCL-GFP带有绿色荧光蛋白，通过两个辅助载体包装成的慢病毒颗粒转染细胞后能够通过观察绿色荧光蛋白的表达来计算转染效率。本研究表明，慢病毒介导的VEGF干扰质粒构建成功，包装后形成的病毒颗粒在MOI值为50时能够感染80%的细胞，感染后的细胞VEGFmRNA表达显著降低，这就为后续研究干扰病毒对瘢痕的作用奠定了基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2011-04-15 [修回日期]2011-06-20
　　编辑/张惠娟