[灵芝液体发酵培养及其药理作用研究进展]灵芝的药理作用

　　[摘要] 灵芝(Ganoderma lucidum), 俗称灵芝草, 古称瑞草, 分类学上属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属植物。灵芝是我国著名的药用真菌和新资源食品，在我国有2000多年的历史，有“益心气，人心生血，助心充脉，安神，益肺气，益脾气，补气，坚筋骨，利关节，治耳聋”等功效，在营养、保健和医疗方面均有极高的营养价值。根据我国第一部药物专著《神农本草经》记载：灵芝分为青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝和紫芝六种，其药用价值受到了历代医者的推崇。随着现代科学技术的不断进步，对灵芝的研究也进一步深入。目前的研究认为灵芝的主要生物活性成分包括灵芝多糖和三萜等。近年来，采用液体深层发酵技术生产获取灵芝多糖和三萜等成分的研究取得了不少进展。与此同时，现代医学研究也证明灵芝对于慢性支气管炎、冠心病、肝炎、高血脂症、神经衰弱等多种疾病均有不同程度的疗效[1]。本文就灵芝液体的发酵培养及其药理作用的研究现状和发展做一综述。
　　[关键词]灵芝； 液体发酵； 药理作用
　　[中图分类号] R932[文献标识码] B[文章编号] 1005-0515（2011）-02-053-02
　　
　　1 灵芝的液体发酵培养
　　1.1 菌种的筛选
　　灵芝属种质资源十分丰富，仅我国就有98种，但是目前对灵芝的研究主要集中在赤芝(Ganoderma lucidum) 和松杉灵芝(Ganoderma tsugae)两个种，还有大量的物种资源尚待开发[2]。近年来研究证实，沂山灵芝、紫灵芝、赤芝G22生长速度快，液体培养获得的生物量、菌丝多糖含量也比较高；而日本红芝、京大、树舌灵芝3个品种则是多糖和三萜含量均相对较高，故均可作为优势菌种[3-6]。
　　灵芝无论是多糖还是三萜含量在不同菌株间都存在着显著的差异，且多糖和三萜二者的含量之间并不存在着必然联系，多糖含量与菌丝体生物量之间也没有相关性，确定优势菌种要对灵芝菌种的各项生理生化指标进行综合权衡[6]。此外，在筛选菌种时，除测定总多糖和三萜含量外，增加药理活性的测定也是十分必要的[7]。
　　1.2 培养基的配方组成
　　1.2.1 碳(C)源对灵芝液体发酵的影响
　　灵芝发酵中应用的常规碳源有葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、酒糟等。灵芝对单糖、双糖、多糖和天然农副产品等均能较好地利用,其中以蔗糖为碳源的发酵培养基菌丝体产胞内粗多糖的量最多[5]。使用复合碳源对提高发酵灵芝多糖和灵芝酸的产量有利[8]。直接使用玉米水解糖可省去用玉米制淀粉和葡萄糖的工序，具有成本低、营养全面，进而显著提高活性多糖产量的作用，因此可以作为最适碳源[9]。
　　碳源的影响不仅在于其成分，还在于其用量。充分的碳源供应是保证菌丝体中多糖含量的关键。灵芝用葡萄糖作碳源时最适浓度为2 %～5 %，更高浓度(8 %)则不利菌丝生长[10]。
　　1.2.2 氮(N)源对灵芝液体发酵的影响
　　一般灵芝适用的氮源有蛋白胨、豆粕粉、玉米粉、麸皮、硝酸铵、硫酸铵、 氯化铵、谷氨酸等，在所有的氮源中，灵芝对有机氮源的利用优于无机氮源，有机氮源菌丝体产胞内粗多糖的量及胞外粗多糖的量都明显高于无机氮源；单一的无机氮源对菌丝体生长和胞外粗多糖的分泌都不利，而在有机氮源中,添加0.2%玉米粉的培养基产多糖较多，添加玉米粉的培养基多糖产量最高，因此有研究选用玉米粉作为最适氮源[5]。氮源限制或过量对菌丝体生长均不利，但限制供应可提高低分子量多糖的含量[10]。
　　1.3 无机盐对灵芝液体发酵的影响
　　灵芝生长需要的基本元素为磷和镁，磷主要参与糖代谢，镁离子存在于细胞膜和细胞壁（建议补充镁的作用，以和磷进行对应），如果二者的量存在不足，菌体将不会获得良好的生长。研究证实，缺乏磷酸盐可显著降低菌丝体中的多糖含量，而限制镁离子的供应则能得到大分子量的低产量多糖[10]。其他一些元素如钾、硫、钙、铁的存在也可促进菌体生长。其中钙离子一般使用碳酸钙，其可调节发酵液的pH。而在发酵培养基中加入0.2%的Fe2 +有则利于灵芝胞外多糖产量的提高[5]。还有一些无机盐如锌、硒等，对灵芝的生长并非必需，但灵芝对它们有一定的富集作用，可通过在培养基中添加来转换成人体易于吸收的有机物[11]。
　　1.4 接种量对灵芝液体发酵的影响
　　接种量对菌丝生长有较大影响，但对最终菌丝干重影响不大[11,12]。接种量对灵芝多糖和灵芝酸的产量也是有影响的[13，14]。摇瓶培养时，大量接种(670mg DW/L)可以获得较高产量的多糖,而低的接种浓度(170mg DW/L)则能得到较多的灵芝酸产量。一般摇瓶湿重接种量在10%左右，随其它发酵条件的设置而略有差别[11]。进行大规模发酵罐培养时，由于培养时间往往较短，需要接入更多的种子液。
　　1.5 pH值对灵芝液体发酵的影响
　　一般培养灵芝的适宜pH范围为5.0～6.5，但针对不同产物生产的最适初始pH并不相同。以菌丝体生物量和灵芝酸为获取目标时，初始pH最佳为6.5左右，即为培养基的自然pH[11,15]。以多糖产量为获取目标时，则pH在3.5～6.0的范围内为好，低pH的初始培养基可提高多糖产量[15]。
　　1.6 温度对灵芝液体发酵的影响
　　灵芝发酵的生长温度范围较广，在22～35℃内都可以生长[1,16]。但最佳的生长温度范围要窄一些，并且合适的菌丝生长温度与多糖和三萜的生长温度不一致。考虑到菌株差异及其他发酵因素的影响，合适的菌丝生长温度在25～28℃范围内。稍高于此范围的温度(27～30℃)，则能提高目的产物多糖和三萜的产量[16]。
　　1.7 溶氧量对灵芝液体发酵的影响
　　灵芝发酵过程中溶氧的控制是个很重要的参数。氧气供应在发酵工业上是通过通气和搅拌来实现的。过高和过低的通气及搅拌均不利于灵芝发酵。李平作等发现在25 L发酵罐内选择1:0.75vv/m的通风量和180r/min的转速效果较好[17]。提高搅拌转速可使产生的菌球小而多糖含量高,通风大可增加最终生物量，较低的溶氧环境可促进灵芝酸的产量[17,18]。
　　1.8 培养时间对灵芝液体发酵的影响
　　灵芝摇瓶培养研究发现，发酵过程的产物形成时间顺序依次为，胞外多糖，菌丝，三萜[11]。选择合适的培养时间十分关键。培养前期的三萜类成分少，含量低，活性低，只有到达培养后期各组分才会不再增加，而只在含量上发生改变[15]。因此，实际生产中应当按照对产物的要求来选择合理的培养时间。
　　2 灵芝的主要药理作用研究
　　2.1 灵芝的抗肿瘤作用
　　2.1.1 体外抗肿瘤研究
　　灵芝三萜类化合物具有明显的体外细胞毒作用。灵芝子实体的醇提取物能抑制MCF-7人乳腺癌细胞的增殖并呈剂量和时效关系，同时能促使MCF-7发生凋亡（补充相应的文献，下同）[19]。灵芝发酵液中的灵芝酸在体外可显著抑制人肝癌细胞株BEL7402的生长。灵芝发酵菌体三萜和发酵液中三萜均对肉瘤细胞L290、肠癌细胞SW620、血癌细胞K562和肝癌细胞BEL7402有显著抑制作用。灵芝提取物中存在诱导 PC12 瘤细胞的物质，能抑制小鼠嗜铬细胞瘤PC12 细胞增殖，并促其分化。这种诱导细胞分化作用是灵芝抗肿瘤作用的机制之一[20]。
　　2.1.2 体内抗肿瘤研究
　　灵芝多糖具有显著的体内抗肿瘤活性。灵芝菌丝体中提取出的灵芝多糖GLP可抑制C3H小鼠中纤维肉瘤的生长及向肺部转移，并能显著延长LLC荷瘤C57BL/6小鼠的寿命。此外，灵芝菌丝体提取物对C3H小鼠的肌纤维恶性肿瘤有明显的抑制作用，对肺部转移病灶亦有抑制作用[20]。灵芝子实体中水溶性多糖FI0-a及FI0- b对小鼠S180的抑瘤率分别为50.5 %、61.8 %，并能够明显延长小鼠生存周期[21]。
　　灵芝三萜也表现出显著的体内抗肿瘤活性。灵芝子实体中的灵芝酸F能抑制小鼠脾内移植性LLC初期实体瘤的生长并抑制其向肝转移以及转移瘤的生长。同时该物质在体外能抑制肝素诱导的肿瘤血管新生。灵芝总三萜提取物和酸性三萜提取物均可抑制C57BL/6小鼠体内的B16黑素瘤细胞的生长，其中总三萜提取物具有更强的抑制作用[20]。
　　2.2 灵芝的镇咳、祛痰作用
　　灵芝发酵全液，中、高剂量灵芝酸乙醇提取物和灵芝酸正丁醇提取物组均可降低小鼠气道敏感性，延长咳嗽的潜伏期，各提取物均增加气道和机体耐力，有明显的镇咳作用。正丁醇酸性提取物可显著增加小鼠气管酚红排泄量，有明显的祛痰作用，机制可能在于，灵芝活性成分灵芝酸能促进气管的纤毛柱状上皮的再生和气管软骨变性的修复；抑制组织胺的释放和拮抗乙酰胆碱，从而实现对于气管平滑肌的解痉作用。而且，灵芝酸性物质的镇咳、祛痰疗效也明显优于阳性对照市售双黄连口服液（20mL/kg）[22]。
　　2.3 灵芝抗慢性支气管炎作用
　　由小鼠肺组织病检报告可知，给药组与单纯烟熏组相比较，气管、支气管粘膜损伤有明显好转，慢性支气管炎的组织病理学变化明显轻于单纯烟熏组；且发酵全液及两组灵芝酸提取物对损伤的修复差异不明显，受试样品效果与双黄连组相当，表明这3种受试样品对慢性支气管炎有较好的抗炎、抗损伤作用，这可为灵芝发酵类产品的研究开发提供一定的药理依据[22]。
　　2.4 灵芝免疫调节作用
　　体外免疫活性分析发现，灵芝的菌丝体多糖提取物能显著激活巨噬细胞吞噬、产生NO,促进脾细胞增殖。灵芝菌丝体多糖提取物在100μg/mL时可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，与对照比差异显著。当小鼠脾细胞受ConA刺激时，灵芝多糖提取物能抑制细胞增殖，显示出多糖免疫调节的双重活性[7]。灵芝具有细胞和体液免疫调节作用，从免疫学角度来看，灵芝抗肿瘤作用与其激活免疫效应细胞（特别是巨噬细胞和脾细胞），促进巨噬细胞和T细胞中TNF-α和IFN-γmRNA的表达，从而产生TNF-α和IFN-γ有着密切的关系[20]。
　　2.5 灵芝的其他药理作用
　　灵芝多糖肽(GLPP)具有体内外抗氧化作用，且其抗氧化作用与清除氧自由基或提高GSHpx水平有关。灵芝菌丝体含氮多糖能显著地提高红细胞中SOD的活性, 从而对机体起到保护作用[20]。从灵芝菌丝体中分离得到的多糖GLP具有抑制单纯疱疹病毒I型感染的作用, 定量PCR试验进一步证明GLP发挥抑制疱疹病毒感染作用是通过阻断疱疹病毒对细胞的吸附来实现的[2]。灵芝腺苷衍生物有较强的降血液粘度的效果，能抑制体内血小板聚集，提高血红蛋白2，3-二磷酸甘油的含量，提高血液供氧能力和加速血液循环，提高血液、心、脑的供氧能力。此外，灵芝还有降低胆固醇，降低冠状动脉阻力和心肌耗氧量，提高心肌氧利用率，抑制单纯疱疹病毒的感染，镇痛等作用[21]。
　　3 展望
　　灵芝的药用及保健作用历史悠久，东汉时期的《神农本草经》已把灵芝类列为上品药物，即有效无毒的药物。现代医学证明灵芝多糖有广泛的药理活性，包括提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力、消除自由基、抑制肿瘤、抗放射的能力，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA和蛋白质的能力，提高肝脏的解毒、排毒能力等。国内外在免疫调节方面的研究起步较早；而灵芝抗肿瘤作用的现代药理学研究较晚，但近十余年来该研究得到了学者们的广泛关注。尽管已有研究在灵芝免疫调节、抗肿瘤及其抗肿瘤机制方面取得了较大进展，但许多其他药理作用及其分子机制等方面仍不明了，临床分析研究也相当少，因此，灵芝药理作用方面的深入研究尚任重道远。
　　液体深层发酵培养技术具有周期短、产量大、质量稳定可控、无农药污染等优点。在国内关于灵芝液体深层发酵培养的研究较多，培养技术已经比较成熟。虽然灵芝液体发酵产物与子实体成分不尽相同,但液体发酵菌丝体可产生有活性的多糖和三萜类物质已经得到确认。因此，这必将成为今后工业化大规模生产灵芝医药保健产品的坚实基础。
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