阴道加德纳菌基因组DNA用不同方法提取的比较|加德纳菌

　　[摘要] 目的 采用不同方法提取GV基因组DNA，便于后续研究。方法 用不同方法对GV基因组DNA进行提取，对其基因组DNA进行定量检测，以评价不同方法的提取效率。结果 加德纳菌基因组DNA提取以改良法提取率较高,酚氯仿抽提法、醋酸钾法次之,碱裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法提取效率较差,加热煮沸法提取效率低。结论 改良法提取GV基因组DNA效率较好,适用于临床应用。
　　[关键词] 阴道加德纳菌; 细菌性阴道病; 基因组DNA; 提取方法; 实时荧光定量PCR
　　[中图分类号] R711.31[文献标识码] B[文章编号] 1005-0515（2011）-05-002-02
　　Vaginal Gardner bacteria genomic DNA extracted by different methods of comparison
　　[Abstract] Objective Using different methods of extracting all GV cinemas, facilitating follow-up study genomic DNA. Methods For all GV cinemas by different methods were extracted and genomic DNA on its genomic DNA with quantitative detection, evaluation of different methods of extraction efficiency. Results By bacteria genomic DNA extracted, Gardner improved method of higher extraction yield, phenol chloroform extraction and acetic acid potassium method smoke less, alkali cracking boil law and lysozyme boil law extraction efficiency is poorer, heating boiling method extraction efficiency is low. Conclusion Improved method of extracting all GV cinemas genomic DNA efficiency is better, applicable to clinical application.
　　[Keywords] gardnerella vaginalis; Bacterial vaginal disease; Genomic DNA; Extraction method; Real-time fluorescence quantitative PCR
　　
　　细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)是育龄期妇女常见疾病，在细菌性阴道炎的微生物菌群中阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis,GV)处于优势地位,数量明显高于其他非正常菌群[1]。目前对GV的实验室诊断随着分子生物学技术的发展,PCR技术以快速,敏感和特异等优点迅速地应用到临床。PCR检测细菌的关键之一是模板的选择,即要确定扩增的目的基因。因此,简单实用的细菌基因组DNA的提取是GV研究的基础。本研究通过多种方法提取GV基因组DNA,然后通过定量检测进行比较,建立一种简单高效的细菌基因组DNA提取的方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验菌株GV株为卫生部质控株。
　　1.1.2 试剂 蛋白酶K,溶菌酶,SDS均是Sigma公司生产。
　　1.1.3 仪器 凝胶成像系统为Bio Rad Gel Doc 2000型,PCR仪为Biotronic公司AG-9600型,荧光定量PCR扩增仪为ABI7300。CO2培养箱为日本SANYO公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 菌株培养 将菌株接种于人血琼脂平板上,5%CO2,35℃培养24小时。挑取单个菌落接种于脑心浸出液液体培养基,CO2培养箱培养至2.0麦氏比浊单位。
　　1.2.2 细菌基因组DNA提取方法 ①酚氯仿抽提法1ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10min,去上清液,加550μI TE悬浮沉淀,并加50μI 10%SDS,50μI 20 mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃保温1 h。加150μI5 mmol/L NaCl,混匀。加150μICTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20 min。用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000 rpm离心10min,将上清液移至干净离心管中,用等体积酚:氯仿(24:1)抽提,取上清液移至干净试管中,加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟,沉淀DNA,用70%乙醇漂洗沉淀后,洗干,溶解于100μITE,-20℃保存[2]。②加热煮沸法取1ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10 min,去上清液,加100μITE,100℃煮沸10min,高速低温离心10min(4℃,12000 r/min),取上清液-20℃保存[2]。③溶菌酶煮沸法 取1m细菌过夜培养液,5000rpm离心10min,去上清液,加入溶菌酶100μI (10 mg/ml,1g溶菌酶溶于10 mmol/L Tris-HCL),100℃煮沸10 min,高速低温离心10min(4℃,12000r/min),取上清液-20℃保存[3]。④碱裂解煮沸法取1m细菌过夜培养液,5000 rpm离心10 min,去上清液,加100μI0.2 mol/LNaOH,100℃煮沸10 min,高速低温离心10 min(4℃,12000 r/min),取上清液-20℃保存[4]。⑤醋酸钾法取1ml细菌过夜培养液(麦氏比浊为2.0),5000 rpm离心10min,丢去上清液,收集菌体。加入400μI裂解液(40mM Tris醋酸,20 mM醋酸钠,1mM EDTA,10%SDS,pH7.8)混匀,置于37℃水浴1h。然后加入200μI5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于高速低温离心10 min。取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0),高速低温离心10min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于100μI TE溶液中,置4℃保存备用[5]。⑥改良溶菌酶盐析法将1 ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10 min,弃上清,加入400μI溶菌酶裂解液[1 g溶菌酶溶于5mmol/L NaCl,20 mmol/LTris2HCl,1mmol/L EDTA,8%蔗糖,20 mg/ml蛋白酶K混合液400μI ],加入100μI10%十二烷基硫酸钠,置56℃水浴箱1h;然后加入200μI 5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于高速低温离心10 min。取上清液,加两倍体积无水乙醇沉淀DNA,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于100μI TE溶液中,置-20℃保存备用。
　　1.2.3 基因组DNA纯度和浓度测定 使用UV24019C型紫外分光光度仪检测基因组浓度及OD260/OD280值。
　　1.2.4 普通PCR对基因组DNA定性检测 GV的引物合成参照文献[6],由上海英俊生物公司合成。序列如下:P1,5"-GGGCG GGCTAG AGTGCA3";P2,5"-GAACCCGTGGAATGGGCC-3",产物条带大小为332bp。以GV质控株为模板,以P1和P2为引物,反应体系为25μI Taq mix 12.5μI ,P1μI ,P2 1μI ,模板2μI,dH2O 8.5μI。反应条件:95℃10 min,94℃ 30S,62℃ 30S,72℃ 30S,40个循环,72℃ 7min。使用2%琼脂糖凝胶进行产物检测。
　　1.2.5 FQ-PCR测定 对6种方法提取的GV基因组DNA作荧光定量PCR,引物同上。PCR反应体积为25μI,PCR参数:94预变性5 min,94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 1min,35个循环,最后72℃ 5min结束反应。根据Ct值对提取效率进行判断。
　　2 结果
　　2.1 定性PCR测定结果 对6种方法提取的GV基因组DNA进行普通PCR,PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,均可见332 bp左右的特异性条带。
　　2.2 荧光定量PCR测定结果 对6种方法提取的GV基因组DNA作荧光定量PCR,从左到右,以改良法CT值最低,其次为酚氯仿抽提法、醋酸钾法、碱裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法,加热煮沸法CT值最高。具体结果见图1。
　　 图2FQ PCR测定不同方法提取GV基因组DNA
　　2.3 不同方法提取DNA的比较 通过多次平行试验表明改良法提取效率最高,酚氯仿抽提法和醋酸钾法提取效率次之,碱裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法提取效率较差,加热煮沸法提取率最低。具体结果见表1。
　　表1不同细菌基因组DNA提取方法的比较
　　3 讨论 在临床微生物检验中,常规分离方法是最基础的,也是最广泛的,但是传统的细菌学检验于鉴定的主要依据是形态特征和生理性状,需要进行细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测,方法复杂费时,对有些细菌也往往不能给出理想的鉴定结果[6]。随着分子生物学技术的发展,PCR技术以快速,敏感和特异等优点迅速地应用到临床微生物检测领域。PCR检测细菌的关键之一是模板的选择,即要确定扩增的目的基因。因此,简单实用的细菌基因组DNA的提取是分子生物学技术研究和检测临床细菌的基础。
　　获得一定浓度和纯度的DNA是进行分子生物学研究的基础。破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA的前提,而蛋白质和核酸物质的分离是获得高质量DNA产物的关键。目前,细菌基因组DNA提取方法有酚抽提法,专用DNA提取试剂盒法,碱裂解法,加热煮沸法,溶菌酶裂解法,SDS裂解法,及其他破壁方法(超声破碎,研磨破碎,反复冻融等)[7]。DNA经典分离方法是酚/氯仿抽提法,该法虽然效率较高,但费时费力,而且其操作中要求多次离心,增加了样品污染的可能性。在DNA溶液中的酚类等有机物质对DNA聚合酶有抑制作用,特别是在PCR扩增过程中会对扩增过程产生抑制作用。由于采用有机溶剂的处理,试剂有一定的毒性,大量应用有害健康,不适合常规应用。加热煮沸法时间短,操作简单,但加热过程中会有少部分DNA降解导致提取效率较低,同时其最大缺陷是无法提取革兰氏阳性菌基因组DNA;碱裂解法是一种简便的细菌基因组DNA提取方法,但该法提取采用强碱具有一定的腐蚀性;SDS裂解法及溶菌酶法一般需要复杂的裂解液体系并借助蛋白酶K和RNA酶的帮助来获得高质量的抽提产物,部分药品及相关酶试剂价格昂贵[8]。DNA专用试剂盒提取法提取细菌基因组DNA效果好但成本较高,临床应用受到限制。
　　本文对上述其中几种提取细菌基因组DNA方法进行了对比实验,研究结果证实了各种方法的优缺点。加热煮沸法操作简单,但提取效率低。为缩短操作时间,本研究中将溶菌酶法和碱裂解法与煮沸法结合,碱裂解法提取效率要好于溶菌酶法。本实验结果表明单独使用溶菌酶不能达到良好的提取效果。酚氯仿提取法是经典的提取方法,提取效率较好,但操作繁琐,耗时长。虽然DNA得率高,但荧光定量PCR的CT值却偏低,证实了可能有少量酚残留对PCR扩增的抑制作用。醋酸钾法是用SDS破壁,高盐低PH溶液沉淀蛋白质,用酚氯仿抽提,提取效率稍差。本实验改良法中我们将溶菌酶法和盐析法结合并进行了改良,一次同时加入溶菌酶消化,蛋白酶K降解蛋白,SDS充分裂解细胞并去除有机杂质,然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质,并经离心除去,上清直接用乙醇沉淀DNA。该法简化了DNA的抽提步骤,减少了有机溶剂的使用,提取的DNA具有较高的浓度和纯度,适合临床应用,建议各实验室可根据具体要求来合理地选用DNA的提取方法及试剂。
　　参考文献
　　[1] 李连青,朱庆义,刘俊芬,等.阴道加德纳菌对细菌性阴道病的病原学诊断评价[J].中华医院感染学杂志,2005,15(2):226.
　　[2] Witt A,Pet ricevic L,Kaufmann U,et al.DNA hybridization t est:rapiddiagnostic tool for excluding bacterial vaginosis in pregnant women wit hsymptoms suggestive of infect ion[J].J Cl in Microbiol,2002,40(8):3057.
　　[3] 张龙祥,张庭芳,等编.生化实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社,1996.
　　[4] 萨姆布鲁克,弗里奇,曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(金冬雁译)[M].第2版.北京:科学出版社,1995:463-469.
　　[5] Antonio MA,SE Hawes,SL Hill ier.The identificat ion of vaginal Lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics ofwomen colonized by these species[J].J Infect Dis,1999,180:1950.
　　[6] Coyne SR,Craw PD,Norwood AD,et al.Comparat ive analysis of theschleicher and schuelliso code stix DNA isolat ion device and the QiagenQIAamp DNA mini kit[J].J Clin Microbiol,2004,42(10):4859.
　　[7] 马蔡昀,童明庆,文怡,等.细菌性阴道病实验室诊断方法的比较[J].医学临床研究,2005,22(7):919.
　　[8] 余道军,童文娟,陈岳明,等.临床标本细菌基因组DNA提取方法探讨[J].中国微生态学杂志,2007,(19)6:519.
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