流感病原学检测_一起新甲型H1N1流感疫情的流行病学调查和病原学检测

　　[摘要] 目的 解一起流感疫情局部暴发的流行特征,查明疫情中的病原体,为今后有效开展流感防治工作提供科学依据。方法 集疑似流感患者咽拭子标本,采用荧光定量RT-PCR法快速检测标本中是否存在流感病毒核酸,结合临床症状及实验室检测结果进行综合分析。结果 起流感疫情共发病132例,罹患率为12.6%。发病年龄主要集中在16～18岁,男女性别比为4.28:1,从25份患者标本中进行新甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测,有19份阳性。结论 次疫情为一起校内新甲型H1N1流感局部暴发,荧光定量RT-PCR法为疫情病原体的确定提供实验室依据,为疫情的处理提供了及时正确的指导方向。今后应加强学校流感监测工作,做到早报告、早隔离、早治疗。
　　[键词]型甲型H1N1;流感病毒;荧光定量PCR;流行病学调查
　　[中图分类号] R373.1+3[文章标识码]A[文章编号]
　　
　　Epidemiologic Survey and Pathological detection of A Case of Novel Human Influenza A Infection
　　Fang qiaoyun, Ju xiongfei, Liu xuemei, Qiu wenqing, Chen minmin
　　(Huizhou Center for Disease Control and Prevention, Huizhou 516008,
　　Guangdong, P. R. China)
　　[bstract] Objective To study the pathogen and epidemiological characteristics of influenza in order to provide basis for setting measure for the control and prevention for
　　this disease.MethodsThe influenza viruses were isolated from throat swabs and detected the nucleic acids by fluorescence quantitative RT-PCR,A case of influenza was analyzed by epidemiological investigation and pathological examination.Result Of this outbreak, 132 cases were reported, and the morbidity rate was12.6%. The occurrence rate in male was significantly higher than that in female,the sex ratio for the 4.28:1, age of onset mainly concentrated in 16～18 years.25 specimens were detected by fluorescence quantitative RT-PCR, and 19 of those were positive as novel human influenza A (H1N1).Conclusion The results showed that this local outbreak was a novel human influenza A (H1N1) in schools. Fluorescence quantitative RT-PCR can provide a laboratory basis and a right instruction in time in the control and processing of the epidemic situation. In the future, we should strengthen influenza surveillance work of the school, and early reporting, early quarantine and early treatment.
　　[Keys words] novel human influenza A (H1N1); influenza virus; fluorescent quantitative PCR; epidemiological investigation
　　2009年9月2日,惠州市某学校发生一起以发热、咳嗽、咽痛、头痛为主要症状的流感样疫情。为了判断是否是新甲型H1N1流感病毒感染,并排查是否是季节性流感和H5N1禽流感病毒,我们采用5种试剂组合进行快速排查,这5种试剂分别检测甲型H1N1、H3N2流感病毒核酸、H5N1亚型禽流感病毒核酸、乙型流感病毒核酸、新甲型H1N1流感病毒核酸。经流行病学调查、临床观察治疗和实验室检测确定为新甲型H1N1流感暴发。为了解其发病特点并指导今后的流感防治工作,现将这起疫情调查处理情况报道如下。
　　1 材料和方法
　　1.1病例定义 发热(体温≥38℃),伴咳嗽或咽痛之一者,同时缺乏其他实验室诊断依据。
　　1.2 资料来源病例资料来源于现场流行病学调查,病例调查根据广东省统一的《甲型H1N1流感病例个案调查表》的要求,对病例开展个案调查。
　　1.3 标本采集 采集首发病例及出现流感样症状的部分患者的咽拭子标本。标本采集后4℃冷藏运送,实验剩余样本置实验室-70℃低温保存。
　　1.4 实验室检测
　　1.4.1 病毒RNA的提取 采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit,严格按照试剂盒操作说明书进行,提取的RNA立即进行实验或-70℃保存。
　　1.4.2新甲型H1N1流感病毒 采用美国应用生物系统(Applied Biosystems,ABI)公司的一步法TaqMan EZ RT-PCR检测试剂盒进行检测。反应体系:2X RT-PCR反应液:12.5 µl、25X RT-PCR Enzyme mix:2 µl、引物终浓度400 nM,TaqMan 探针终浓度120 nM、detection enhancer:0.5 µl、标本RNA 5 µl,加水至25 µl,其中上游引物序列为:5’-GGGTAGCCCCATTGCAT-3’,下游引物序列为:5’-AGAGTGATTCACACTCTGGATTTC-3’, 探针序列为:5’-(FAM)TGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGG(TAMRA)-3’;试剂混匀后移入毛细玻璃反应管中,盖紧管盖,1000r/min离心30s,转移入荧光定量PCR仪器。反应条件:第一阶段45℃,10 min;第二阶段95℃,10 min;第三阶段95℃,15 s,60℃,45 s, 40个循环。在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。
　　1.4.3 季节性流感病毒和禽流感病毒
　　甲型H1N1、H3N2流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测均采用广州华银医药科技有限公司生产的试剂盒,反应体系参照试剂盒说明书配制,试剂混匀后移入毛细玻璃反应管中,盖紧管盖,1000r/min离心30s,转移入荧光定量PCR仪器。反应条件:第一阶段37℃,25 min;第二阶段94℃,2 min;第三阶段94℃,15 s,55℃,15 s,72℃,20s,5个循环;第四阶段94℃,5 s,55℃,35 s,32个循环。在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。
　　1.4.4 结果判断阴性对照应无Ct值且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应30的样本重做,重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性。
　　2 结果
　　2.1 流行病学调查
　　2.1.1 发病经过及流行强度
　　首例病例,林某,男,于8月31日下午自觉发热,9月1日上午到校医室测量体温为38.7℃,校医给予先锋、喉症丸、泰诺等药治疗,不见好转,于当天下午向该班班主任请假回家居家治疗。随后该生所在班级及相邻班级陆续出现多名流感样症状的患者。截至9月14日,共发病132例,罹患率为12.6%。
　　2.1.2 时间分布
　　首例8月31日发病,末例9月14日,流行期15天。病例在9月2日、6日呈现出两个发病高峰,共76例,占发病总数的57.6%,见图1。
　　2.1.3 人群分布 132例病例中,男性107例,占81.06%,女性25例,占18.94%,男女比例为4.28:1。年龄分布在14～27岁之间,年龄平均为17.4周岁,其中发病最多的为16岁～18岁,共100例,占发病总数的75.76%,见表1。
　　2.2 临床表现
　　132例病人中临床表现以发热、咽痛、咳嗽、头痛、乏力、全身酸痛症状居多,部分病例有流鼻涕、打喷嚏和腹泻等症状。最高体温40℃,平均体温为38.5℃。大部分病程在3～5天,给予退热等对症治疗后病情得到控制,无重症病例,无死亡病例。
　　2.3 病原学检测
　　此次疫情共采集标本25份,全部检测了甲型H1N1流感病毒核酸、甲型H3N2流感病毒核酸、H5N1亚型禽流感病毒核酸和乙型流感病毒核酸结果均为阴性。25份标本进行新甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测,见图2,其中有19份阳性,阳性率为76%。
　　3 讨论
　　此起疫情正值全球新甲型H1N1流感高发之时,值得高度关注。根据患者的临床表现、流行病学特征及流感快速检测结果,可以推断本次突发公共卫生事件是一起由新甲型H1N1流感病毒引起的局部暴发流行。经流行病学调查等综合分析,宿舍拥挤、卫生设施不完善,通风条件较差,容易导致病毒的传播,学生均未接种过新甲型流感疫苗,普遍对流感病毒缺乏有效免疫等因素可能是引起本次疫情的原因。
　　目前国内外用于诊断流感的检测方法主要有病毒的分离和血清学诊断反应等,但这些传统的方法操作较为繁琐,所需时间长,敏感性不高,且结果的重复性也不是很好,不适于暴发疫情的快速检测,及时快速的检出病原体对疫情的控制有着非常重要的作用,Leo Poon[1]他们发现PCR检测方法可检测早期感染的新甲型H1N1流感病人,至少比病毒分离方法敏感500倍。所以目前新型甲型H1Nl流感病毒的快速检测主要依赖于分子生物学的方法[2]。荧光定量PCR技术可在数小时内出结果,同时具有很多优点[3,4],如特异性高,敏感性高,采用封闭反应管、无需凝胶电泳、实时监测结果,可对PCR产物进行定量分析等。荧光定量PCR技术在暴发疫情的应急检测中具有很高的应用价值。
　　本次流感暴发流行之所以能够得到迅速控制,主要是由于:(1) 各级领导高度重视和有关部门全力配合。(2) 反应迅速,判断准确。疫情发生后,各部门反应迅速,共同开展流行病学调查、样本采集与防控措施的研究等工作,为查明原因控制疫情蔓延奠定了基础。(3) 措施果断有力。在确定为新甲型H1N1流感暴发后,对在校学生严格采取晨检、午检和晚检制度。一旦发生疑似病例,迅速采取居家隔离治疗病人、停课等措施,为成功控制疫情并阻止疫情向更大范围扩散提供了保障。要控制流感疫情的发生和流行,今后,我们需要做好以下工作:(1) 做好流感疫情的监测与预警工作;(2) 进行突发事件应急处理技术的专业培训,开展流感防治知识的健康教育工作;(3) 全面提升实验室病原分子生物学检验检测技术水平,及时为医疗卫生机构在疫情处理、快速诊断和有效救治方面提供病原学依据。
　　此次由新甲型H1N1流感病毒引起的流感疫情染性、传播途径复杂、流行强度大、传播快,几乎波及全球各地,而对新甲型H1N1流感感染者尚无特异、高效的抗病毒药物,人类正面临着一种新的考验。由新甲型H1N1流感病毒引起的疫情应引起高度重视,尽早采取相应的预防措施。
　　
　　参考文献
　　[1] Leo L.M. Poon, K.H. Chan, G.J. Smith, et al. molecular detection of a novel human
　　influenza (H1N1) of pandemic potential by conventional and real-time quantitative RT-PCR assays[J]. Clinical Chemistry, 2009, 55(8):1555-1558.
　　[2] World Health Organization. CDC protocol of real-time RT-PCR for swine influenza A (H1N1). http:// www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/ realtimeptpcr/en/index.html (Accessed May 5,2009).
　　[3] Heid CA,Stevens J,Livak KJ,et a1.Real time quantitative PCR[J].Genome RES,1996,6(10):986-994.
　　[4] Habib-Bein NF,Beckwith WH,Mayo D,et a1.Comparison of Smart-Cycler real-time reverse transcription-PCR assay in public health laboratory with direct immunofluorescence and cell culture assays in a medical center for detection of influenza A virus[J].J Clin Microbiol,2003,41(8):3597-3601.